HPLC测定不同产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的含量

　　　　 作者：胡华杰 楼招欢 吕圭源 陈素红

【摘要】 ［目的］采用HPLC法测定不同产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的含量。［方法］色谱柱：XBC18分析柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相：乙腈水，梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1。［结果］欧前胡素在0.0552～0.276μg范围内线性关系良好，平均加样回收率为99.5%，RSD为1.3%；异欧前胡素在0.048～0.24μg范围内线性关系良好，平均加样回收率为98.6%，RSD为1.7%。不同产地的白芷饮片中欧前胡素含量在0.046%～0.145%之间，异欧前胡素在0.038%～0.087%之间，两者之和在0.084%～0.232%之间。安徽产最低，浙江杭州产最高。［结论］不同产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的含量存在差异。含量测定方法准确、快速、重复性好，适用于白芷及其制剂的质量控制。

【关键词】 白芷饮片；欧前胡素；异欧前胡素；HPLC

　　Abstract： ［Objective］ To determine the contents of imperatorin and isoimperation in Angelicae dahuricae from different sources by HPLC，and prove some scientific evidence for processing standardization and quality control of Angelicae dahuricae decoction pieces.［Methods］ An HPLC method was established.XBC18 column was used，with mixture of acetonitrile and water in a gradient mode.The flow rate was 1.0mL·min-1.［Result］ The calibration curve of imperatorin was in good linear over the range of 0.0552～0.276μg with the average assay recovery 99.5%.The calibration curve of isoimperatorin was linear over the range of 0.048～0.24μg with the average assay recovery 98.6% （RSD=1.7%）.The contents of imperatorin from different sources in Angelicae dahuricae were between 0.046%～0.145%，isoimperatorin was between 0.038%～0.087%，the total was between 0.084%～0.232%.［Conclusion］ This method was proved to be rapid，reproducible and accurate.It is suitable for the quality control of Angelilae dahuricae and its preparation.

　　Key words：Angelica dahurica; imperatorin; isoimperatorin; HPLC
　　
　　白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan 的干燥根。白芷中主要有效成分为香豆素类化合物，药理实验表明其具有抗菌消炎、解热镇痛、降低动脉压力及离体蛙心收缩力等作用，具有较强的生理活性，欧前胡素和异欧前胡素为其中的主要化学成分之一［1］。本实验通过测定不同产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的含量。

　　1 材料

　　1.1 药物与试剂

　　白芷饮片购自各地药店和药房，产地分别为浙江金华、浙江杭州、安徽、四川；欧前胡素（批号：110826200712）和异欧前胡素对照品（批号：110827200407）均购于中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

　　1.2 仪器

　　Agilent 1200 高效液相色谱系统；VWD检测器；AG135电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；超声波清洗器（上海申波超声公司）。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：XBC18分析柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A（水）C（乙腈），梯度洗脱，起始浓度为95%A～5%C，在50min时达到35%A～65%C，最后在70min时达到5%A～95%C；流速：1ml·min-1；检测波长：254nm，柱温：30℃。在此条件下，欧前胡素、异欧前胡素与白芷饮片中其他成分能达到基线分离，理论塔板数按欧前胡素峰计算不低于3000。见图1、图2。

　　2.2 对照品溶液的制备

　　精密称取欧前胡素、异欧前胡素对照品1.38mg和1.20mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇配制成浓度分别为0.0552 mg·min-1和0.048 ml·min-1的混合对照品溶液，摇匀，即得。

　　2.3 供试品溶液的制备

　　取白芷粉末（过3号筛）约1.000g，精密称定，置锥形瓶中，加70%乙醇25ml，称重，超声30min，取出，放冷，补足失重，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

　　2.4 标准曲线的绘制

　　精密吸取混合对照品溶液以不同体积注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以对照品的进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归计算，其方程为：欧前胡素 Y=5.53×103x+27.31（r=0.9995），在0.0552～0.276μg范围内线性关系良好；异欧前胡素Y=4.68×103x+19.62（r=0.9995），在0.048～0.24μg范围内线性关系良好。

　　2.5 精密度实验

　　精密吸取同一供试品溶液，连续进样5次，根据峰面积计算得欧前胡素、异欧前胡素的RSD均为0.24%，表明仪器精密度良好。

　　2.6 稳定性实验

　　取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24h进样，按上述色谱条件测定欧前胡素、异欧前胡素的峰面积，计算RSD。结果表明，欧前胡素与异欧前胡素在24h内基本稳定，RSD分别为0.26%和0.29%。

　　2.7 重复性实验

　　取白芷饮片，照“2.3”项下方法制备供试品溶液5份，按上述色谱条件测定，计算得欧前胡素、异欧前胡素的平均含量分别为0.14%和0.08%，RSD分别为1.79%和2.18%，表明该方法重现性良好。

　　2.8 加样回收率实验

　　取白芷粉末（过3号筛）约0.45g，称定，分别加入已知浓度的对照品溶液适量，照“2.3”项下方法制备加样回收供试品溶液，测定，计算欧前胡素的平均加样回收率为99.5%，RSD为1.3%；异欧前胡素的平均加样回收率为98.6%，RSD为1.7%。见表1、表2。表1 欧前胡素加样回收率实验结果（略）表2 异欧前胡素加样回收率实验结果（略）

　　2.9 样品含量测定

　　照“2.3”项下方法制备各供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积采用外标法计算含量，结果见表3。表3 不同产地白芷饮片含量测定结果(略)

　　3 讨论

　　3.1 提取溶剂的选择

　　本实验选用了甲醇、乙酸乙酯、乙醚、35%乙醇、70%乙醇和95%乙醇为超声提取溶剂，以欧前胡素和异欧前胡素的含量为考察指标，发现以甲醇和70%乙醇为提取溶剂时含量相近。考虑到甲醇的毒性，故选择70%乙醇为提取溶剂。

　　3.2 提取方法的选择

　　考察了70%乙醇超声30min、60min、回流提取1h、2h、索氏提取6h、9h等提取方法，发现超声30min和索氏提取9h对两者含量并无太大差别。考虑到实验操作的简便，故选择70%乙醇超声30min为提取方法。

　　3.3 流动相的选择

　　选择了甲醇水、乙腈水、甲醇0.1%冰醋酸等流动相，发现以乙腈水为流动相时色谱图基线和分离度都较好，故选择乙腈水为流动相。

　　3.4 结果分析

　　生产实际中，为了有效地防止腐烂的大量发生，通常将白芷完全熏透，而硫熏后白芷的有效成分香豆素类成分损失较大［1］。目前对于白芷的新的炮制工艺研究较少［2］，各产区的加工方法主要还是硫熏。本实验中测得的不同产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的含量与文献报道的相应产地的白芷药材相比均有较大程度的降低，从一定程度上论证了硫熏对白芷中欧前胡素等香豆素类成分的影响。

　　欧前胡素和异欧前胡素是白芷质量控制的主要指标，本实验测得的不同产地白芷饮片中欧前胡素含量在0.046%～0.145%之间，异欧前胡素在0.038%～0.087%之间，两者之和在0.084%～0.232%之间。除安徽产的含量相对较低外，其它产地白芷饮片中欧前胡素和异欧前胡素的总量比较接近；同一省份不同城市之间白芷饮片中两者的含量存在差异，推测可能是不同地方对白芷的炮制方法存在差异而致。不同产地白芷饮片中香豆素类成分的含量不同，由此是否会导致药理作用的不同，有待进一步的验证。本实验通过同时测定欧前胡素和异欧前胡素的含量，为白芷饮片炮制工艺规范化、质量评价以及临床选用提供科学的依据。

参考文献