针灸预处理对Alzheimer大鼠Wnt1表达的影响

　　　　作者：周华 孔立红 沈峰 曾晓玲 杜艳军 陈邦国 王述菊 孙国杰

【摘要】 目的 建立老年性痴呆（AD）大鼠模型，探讨针灸预处理对AD模型大鼠Wnt1信号转导通路的影响及防治AD的机制。方法 建立AD大鼠模型，随机分为正常组、假手术组、模型组、预艾灸组、预电针组、预电针加灸组。通过实时定量PCR技术检测Wnt1基因表达。结果 模型组大鼠海马Wnt1信号异常减弱，与正常组和假手术组比较差异显著（P＜0.01）。而预艾灸组、预电针组、预电针加灸组大鼠海马Wnt1的信号均有不同程度的增强。结论 针灸防治AD的作用机制可能是通过调节Wnt信号转导通路影响学习记忆相关酶及蛋白在海马区的表达而发挥作用。

【关键词】 针灸；针刺预处理；老年性痴呆；Wnt1信号传导通路

　　【Abstract】 Objective To establish rat models of AD to explore the predisposal on the rat models of senile dementia Wnt signal transduction pathway， and reveal the mechanism of acupuncture treatment of AD.Methods All the rats were pided into normal， sham， model， premoxibustion， preelectroacupuncture， preelectroacupuncture and moxibustion groups at random. Results Wnt1 gene singal expression was observed to weaken abnormally in model rats. There were significant difference between the model group and sham， normal groups (P＜0.01)， while the Wnt1 singal were reinforced in preelectroacupuncture， premoxibustion and preelectroacupuncture groups in different degree. Conclusions The adjusting mechanism of acupuncture to prevent and cure dementia is likely to regulate the Wnt signal transduction pathways and affect the relevant enzymes and proteins′ expression of learning and memory in the hippocampus.

　　【Key words】 Acupuncture; Acupuncture and moxibustion; Predisposal; Dementia; Wnt1

　　阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）又称为老年性痴呆，是一种主要表现为认知功能障碍、日常生活能力丧失及精神行为异常的神经系统退行性变性疾病，是严重危害老年人身心健康的重大疾病之一。针灸防治该病取得了满意的疗效，其作用机制尚未十分明确。本课题通过实时定量（RT）PCR技术检测针灸预处理对AD模型大鼠Wnt1信号转导通路的影响，揭示针灸防治AD的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　22～24月龄雄性清洁级（SD）大鼠30只，体重(480±20) g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，符合SD级实验动物标准。随机分为正常组、假手术组、模型组、预艾灸组、预电针组、预电针加灸组。

　　1.2 试剂及主要仪器

　　Trizol RNA抽提试剂；MMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、RNAsin；PCR引物及寡聚核苷酸；基因扩增仪；G6805Ⅱ型电针治疗仪。

　　1.3 动物模型制作和筛选

　　大鼠称重，用10%的水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，脑立体定位仪固定头部。颅顶区备皮，剥开皮下筋膜暴露顶骨，消毒手术区皮肤，无菌操作，在两侧冠状缝后钻出小孔，取出碎骨屑，保持硬脑膜的完整。按大鼠脑立体定位图谱〔1〕选择大鼠海马区域进行注射。注射部位：前囟后3.5 mm，中线外侧2.0 mm，硬脑膜下2.7 mm。每侧用微量注射器分别注入聚集肽的淀粉样蛋白（Aβ）2535（0.1%的三氟乙酸将Aβ2535稀释成5 μg /μl，37℃孵育1 w） 1 μl（5 μg），5 min内注完，注射后留针5 min，以免拔针时药物溢出。术后牙托粉封固颅骨孔，缝合皮肤，3 d内每日肌注青霉素G 10万U防治感染。

　　将大鼠分别进行Morris水迷宫测试，剔除天生痴呆大鼠。筛选方法：以15只3月龄青年大鼠为受试对象。第1天让大鼠自由游泳4次，每次2 min以适应水中环境。从第2天起，每日上午和下午分别进行4次水迷宫实验，记录逃避潜伏期的长短，每次每只大鼠测试时间为2 min，2 min内未找到终点者以2 min计算，4 d实验结束后，得出青年大鼠平均逃避潜伏期。再取30只24月龄老年大鼠，时间及方法同前，并计算出每只老年大鼠的平均逃避潜伏期，分别以青年大鼠平均逃避潜伏期均值+2倍标准差值为下限、+1倍标准差值为上限作为评定标准，将老年大鼠进行筛选，选出合格大鼠24只，每组各4只。取双侧海马，液氮中保存，备用。

　　1.4 处理方法

　　正常组：不进行任何处理，作为实验对照组。假手术组：颅内注射等量生理盐水，手术方法及注药方法同模型组。模型组：造模成功后，不进行任何治疗。预电针组：对正常大鼠先施予电针刺激。根据华兴邦提供的大鼠穴位定位和针刺方法，取大鼠“百会”（顶骨正中）、“肾俞”（第2腰椎下两旁），百会向前平刺3～5 mm，肾俞穴稍向内斜刺5 mm，接上海产G6805Ⅱ型电针治疗仪，百会接负极，肾俞接正极，左右侧肾俞每日交替使用。选用连续波、频率2 Hz，以针柄轻微抖动为度，留针20 min，1次/d，6 d为1个疗程，疗程间休息1 d，共3个疗程。电针结束当日即开始给大鼠脑室内注射Aβ2535，造模完毕7 d后继续电针治疗7 d。预艾灸组：正常大鼠造模前先给予艾灸刺激。艾灸方法：采用美容艾条（直径约0.6 cm），取穴同预电针组，于“百会”和一侧“肾俞”上方2～3 cm处用自制固定支架悬灸，左右侧肾俞每日交替使用，使穴位表皮温度在43℃±1℃，持续20 min，1次/d，6 d为1个疗程，疗程间休息1 d，共3个疗程；施灸结束当日即开始给大鼠脑内注射Aβ2535，造模完毕7 d后继续艾灸治疗7 d。预电针加灸组：对正常大鼠先施予预电针组与预艾灸组相同治疗方法，电针和艾灸各10 min，可同时进行。治疗结束当日即开始给大鼠脑室内注射Aβ2535，造模完毕7 d后继续电针加灸治疗7 d。

　　1.5 标本采集

　　每组中各取4只大鼠，以10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg），断头取脑，迅速在冰盘上剥离脑膜，除去嗅球、延髓和小脑，分离双侧海马，置于冰箱-80℃冻存备用。

　　1.6 用RTPCR检测脑组织Wnt1表达

　　1.6.1 引物的设计

　　通过NCBI查找大鼠Wnt1基因序列，应用Primer Primers软件进行引物设计。同样设计βactin为内参照，由武汉谷歌生物科技有限公司合成。

　　Wnt1引物序列(扩增产物为306 bp)：上游：5′GAGGTGAAAGGGCAAGGAAAG3′，下游：5′ GCTGGCAGACAAGAGGAGTGA3′，内参照βactin引物序列(扩增产物为150 bp)；上游：5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游：5′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3′。

　　1.6.2 嵌合荧光（SG）法进行RTPCR检测

　　1.6.2.1 脑组织总RNA的提取

　　①迅速取出大脑海马部位的脑组织100 mg，加入1 ml Trizol，冰浴匀浆碾碎，使组织细胞充分溶解，移至1.5 ml EP管中；②加入氯仿200 μl用力振摇15 s，静置5 min，12 000 r/min离心15 min(4℃)，分层后，取上清转移至新的1.5 ml EP管；③加-20℃预冷的等体积异丙醇，混匀，静置10 min，12 000 r/min离心10 min (4℃)；④弃上清，加预冷的75%乙醇〔用焦碳酸二乙酯（DEPC）配制〕1 ml吹起沉淀，7 500 r/min离心5 min(4℃)；⑤倒弃上清，滤纸吸干，晾5～15 min，溶于DEPC(10 μl)中；紫外分光光度法分析核酸的纯度及定性分析，RNA放入-80℃冰箱中。

　　1.6.2.2 总RNA逆转录成cDNA

　　①冰上取3 μl RNA，1 μl RTPCR混合液，8 μl DEPC，总计12 μl，70℃孵育5 min，0℃冰水浴立刻终止；②4 μl 5×反应液，1 μl核糖核酸抑制剂，2 μl 10 mmol/L脱氧核苷三磷酸底物，总计19 μl，37℃孵育5 min；③加Revert AidTMMMMuLv Reverse Tanscriptase (200 U/μl) 1 μl，42℃孵育20 min，99℃ 5 min，4℃5 min，反应物-20℃保存。

　　1.6.2.3 PCR扩增

　　34 μl ddh30，5 μl 10×Taq液，3 μl 25 mmol/L MgCl2，1 μl 10 mmol/L脱氧核苷三磷酸底物，1 μl上游引物，1 μl下游引物，4 μl cDNA，1 μl Taq DNA聚合酶，总体积为50 μl。反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火15 s，共40个循环，72℃延伸45 s，荧光收集。以扩增倍数作为比较的依据，△CT=CT目的基因－CTβactin，△△CT =△CT实验－△CT对照，扩增倍数=2－△△CT。

　　1.6.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

　　8 μl PCR产物与1 μl上样缓冲液混匀加样，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100 mV 20～30 min，溴化乙啶(EB)显色。

　　1.7 统计学处理

　　所有数据应用SPSS13.0软件统计包处理。实验结果以x±s表示，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　扩增倍数模型组(0.55±0.16)比正常组(1.0±0.33)和假手术组(0.95±0.36)显著降低，有极显著性差异（P＜0.01），预电针组(0.78±0.24)、预艾灸组(0.81±0.18)、预电针加灸组(0.93±0.20)与模型组比较均有极显著性差异（P＜0.01），证实预电针、预艾灸、预电针加灸对于预防痴呆的发生发展具有明显的影响。预电针加灸组与预电针组和预艾灸组比较，有显著性差异（P＜0.05），证实针灸结合预处理效果最佳。

　　3 讨 论

　　Wnt基因是从小鼠乳腺癌中克隆的一种原癌基因，Wnt1蛋白是控制细胞生长、增殖的关键分泌信号分子，可传递细胞间相互调控信息，是19个已知Wnt基因中的第一个成员。有研究证实，干细胞和细胞外基质的相互作用也需要Wnt信号途径的参与〔2～4〕。Wnt信号系统是一个在细胞水平调节的信号系统，在细胞的分化、增殖以及肿瘤的发生、发展等过程中发挥着重要的作用。Wnt信号途径由Wnt特异性跨膜受体卷曲蛋白（Frrizled）、散乱蛋白（dishevelled）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、轴蛋白（Axin）、大肠腺瘤样息肉基因（APC）、β连环蛋白（βcatenin）、T细胞因子/淋巴样增强因子（Tcf/Lef）及其他一些基因的表达产物共同构成。其中βcatenin是正向调节因素，GSK3β、Axin、APC等是负向调节因素，位于βcatenin的上游。

　　当细胞表面无Wnt信号时，胞浆内的βcatenin与GSK3β、APC、Axin三者结合形成一种多蛋白调节复合物，此复合物能促进GSK3β对βcatenin的磷酸化及降解；同时胞浆内高水平的GSK3β可以反馈刺激负性调节分子GSK3β、Axin、APC等的表达，使胞浆内游离的βcatenin蛋白水平维持在一个非常低的浓度，而不能进入细胞核调控相应基因表达。βcatenin的磷酸化需要GSK3β、APC、Axin三者的共同作用：①βcatenin虽是GSK3β的底物，但不能直接被磷酸化，需与APC结合，而βcatenin与APC必须依靠GSK3β对APC的磷酸化，正好APC也是GSK3β的底物〔5〕。②Axin作为支架蛋白能促进GSK3β对βcatenin的磷酸化作用，但GSK3β同样使Axin自身发生磷酸化。磷酸化的Axin不仅增加了它与βcatenin的亲和性〔6〕，也增强了其稳定性而有利于促进βcatenin的磷酸化与降解〔7〕。反之，当细胞接受到Wnt信号后，通过DVL的磷酸化抑制了与Axin结合的GSK3β活性。GSK3β活性的抑制，降低了对APC的磷酸化，使之与βcatenin间失去亲和力；也降低对βcatenin的磷酸化，阻断了βcatenin的降解，这样βcatenin就从复合物中分离，得以在胞浆内积累并可以转移到核内与转录因子结合，进而诱导靶基因转录。

　　与脑的学习和记忆等高级功能有关的大脑皮层、海马和内嗅皮层是AD病理过程中最易受损害的部位，而Wnt在这些脑区都有较高表达。Wnt信号异常减弱引起GSK3β活性增加，可使tau蛋白磷酸化及微管去稳定、βcatenin过度降解和神经元死亡。Wnt系统失常可能与其AD相关的病理变化有关，这包括神经突起的病理改变，磷酸化tau蛋白相关的神经元纤维缠节的形成，神经元丢失以及Aβ堆积形成老年斑〔8〕。近年来研究发现，在精神紊乱患者的大脑中，已经检测到了Wnt1的表达〔9〕。AD脑内Wnt信号通路中的GSK3β活性异常增高〔10〕， 提示Wnt信号系统异常减弱。Garrido〔11〕研究发现GSK3β增多、βcatenin蛋白缺失参与了AD 神经毒性物质的形成，抑制GSK3β的活性、提高细胞核中βcatenin蛋白的水平能减少神经毒性物质的产生。Wang等〔12〕研究发现，鼠的dishevelled1和dishevelled2的过度表达将抑制由GSK3β调控的tau蛋白磷酸化。这些均提示Wnt信号系统失调可能参与了AD相关的病理变化。因此，探讨在Wnt信号及其调节分子在AD病理过程中的调节机制，设法阻止GSK3β的异常升高、βcatenin蛋白的过度磷酸化，抑制tau蛋白异常磷酸化，对预防和延缓神经细胞的退行性变性、改善学习记忆功能具有重要意义。

　　从实验结果可以看出，Wnt可能参与了AD相关的病理变化，在正常大鼠中Wnt信号相对较强，而模型组中Wnt信号明显减弱。经过预处理的各组大鼠Wnt表达比模型组明显增强，证实预处理可预防脑损伤，对AD大鼠的学习和记忆功能具有明显的保护作用，而针灸预处理对AD的防治作用可能是通过调节Wnt信号系统相关酶GSK3β、PP2A的活性，调节相关蛋白βcatenin、Axin的表达实现的。

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