RyR与PKC在UTP对猪冠状动脉平滑肌上STOCs调控中的作用

　　　　 作者：潘雪 李向楠 王鹏 曾晓荣 杨艳 蔡芳

【摘要】 　　目的 探讨三磷酸尿苷（UTP）对STOCs作用的胞内信号转导机制及RyR、PKC对其过程的干预作用。方法 应用全细胞穿孔膜片钳记录技术，观察三磷酸尿苷（UTP）对猪冠状动脉平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道（BKCa）介导的自发性瞬时外向钾电流（STOCs）的作用，及兰诺定受体(RyR) 和蛋白激酶C(PKC)的特异性阻断剂ryanodine、BisI预处理细胞后UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞STOCs的作用。结果 ①50 μmol/L的UTP可使STOCs的幅度与频率明显增加〔(23.53±2.55）pA，（0.2167±0.0217）Hz vs （40.76±5.75）pA，（0.369 5±0.035 8）Hz，n=7，P<0.01〕。②50 μmol/L ryanodine处理细胞后，50 μmol/L UTP不能再激活STOCs。③5 μmol/L的U73122处理细胞后，50 μmol/L UTP也不能激活STOCs〔(22.76±6.43）pA，（0.222 7±0.097 7）Hz vs （23.28±8.43）pA，（0.195 3±0.061）Hz；n=7，P>0.05〕。④1 μmol/L的BisI处理细胞后，50 μmol/L UTP仍可激活STOCs〔(46.32±6.17）pA，（0.407±0.061）Hz vs（65.53±8.34）pA，（0.693 7±0.059 7）Hz；n=10，P1<0.05，P2<0.01〕，且BisI存在时UTP对STOCs的激活作用明显大于UTP单独存在时的激活作用（n=10/7，P1<0.05，P2<0.01)。结论 PLC、RyR和PKC均参与了UTP激活猪冠状动脉平滑肌上STOCs的过程。

【关键词】 自发性瞬时外向钾电流；三磷酸尿苷；兰诺定受体；蛋白激酶C；猪冠状动脉平滑肌细胞；穿孔膜片钳技术

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of uridine 5′triphosphate(UTP) on the cellular signal transduction of spontaneous transient outward currents (STOCs) in porcine coronary smooth muscle cells.Methods Perforatedpatch configuration of patchclamp technique was used to observe the effects of UTP on STOCs of porcine coronary smooth muscle cells as well as the effects after the cells were treated by ryanodine receptor(RyR) inhibitor and protein kinase C(PKC)inhibitor. Results ①50 μmol/L UTP significantly increased STOCs amplitude and frequency compared with that of control〔(23.53±2.55) pA，(0.2167±0.0217) Hz vs (40.76±5.75) pA，(0.369 5±0.035 8) Hz，n=7，P<0.01〕; ②50 μmol/L UTP had no effect on STOCs when the cells had been pretreated with ryanodine receptor(RyR) inhibitor; ③When the cells had been pretreated with phospholipase C(PLC)inhibitor， 50 μmol/L UTP had no effect on STOCs〔(22.76±6.43) pA， (0.222 7±0.097 7) Hz vs (23.28±8.43) pA，(0.195 3±0.061) Hz， n=7， P>0.05〕.④When the cells had been pretreated with protein kinase C(PKC)inhibitor ，50 μmol/L UTP also increased STOCs amplitude and frequency 〔(46.32±6.17) pA，(0.407±0.061) Hz vs (65.53±8.34) pA，(0.693 7±0.059 7) Hz，n=10， P1<0.05，P2<0.01)， moreover in the presence of Bis I， the activation of STOCs by UTP significantly enhanced（n=10/7，P1<0.05 P2<0.01).Conclusions UTP activates STOCs of porcine coronary smooth muscle cells through the PLC pathway， PKC and RYR both involve in regulation of UTP on STOCs.
　　
　　【Key words】 Spontaneous transient outward current; Uridine 5′triphosphate; phospholipase C; Protein kinase C; Porcine coronary smooth muscle cells; Perforatedpatch clamp technique

　　高血压、冠状动脉痉挛等疾病是老年常见病，在这些疾病的病理过程中，血管舒缩活动的调节非常重要。大电导钙激活钾通道( largeconductance Ca2+activated potassium channels，BKCa)在血管平滑肌上分布极为丰富，国内外研究发现BKCa是众多舒血管物质的作用靶点，在血管平滑肌的收缩舒张机制中起着十分重要的作用〔1〕。但BKCa通道对胞浆中的钙具有低敏感性，当钙浓度＞1 μmol/L时才可使其明显激活〔2，3〕，而生理状态下全胞性钙浓度较低且变化有限，因此BKCa在生理状态下调节血管舒缩活动的机制日益引起人们的兴趣。近年来，人们发现胞内钙释放可使局部钙离子浓度升高达10～100 μmol/L，进一步激活邻近BKCa通道开放产生自发性瞬时外向钾电流（spontaneous transient outward currents，STOCs），其可使膜电位超极化达-20 mV，在调节血管平滑肌舒张机制中发挥着重要的作用〔3〕。收缩或舒张因子对STOCs的调控是平滑肌舒缩功能调节的关键环节。但体内收缩或舒张因子对于STOCs的具体调控机制目前还不清楚，国内也未见报道。三磷酸尿苷（uridine 5′-triphosphate，UTP）由内皮细胞所分泌，是P2Y受体的内源性配体，与神经信号传递、肌肉收缩等生理活动密切相关，可激活鸟苷酸结合调节蛋白（guanine nucleoside regulatory proteins，Gq）PLC信号转导通路发挥生物学效应〔4，5〕。嘌呤受体在心血管系统高度密集，对心血管系统的功能具有重要的调节作用。因此深入研究嘌呤受体激动剂对血管平滑肌调控的胞内信号转导机制对于探讨心肌和平滑肌收缩舒张机制，阐明多种心血管疾病的发生发展规律等都具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要溶液与试剂

　　台式液(mmol/L)：NaCl 127、 KCl 5.9、 MgCl2 1.2、CaCl2 2.4、葡萄糖12、 HEPES 10， NaOH将pH调至7.4。无钙台式液(mmol/L)：NaCl 127、KCl 5.9、MgCl2 1.2、葡萄糖12、HEPES 10，NaOH将pH调至7.4。记录STOCs电极内液(mmol/L)：Kaspartate 110，KCl 30，MgCl2 1，HEPES 10，NaCl 10，EGTA 0.05，pH值用KOH调至7.2左右；两性霉素（amphotericinB） 在电极液中浓度为200 μg/ml。记录STOCs浴液(mmol/L)：NaCl 134，CaCl2 1.8，MgCl2 1，KCl 6，葡萄糖10， pH值用NaOH调至7.4左右。酶Ⅰ（mg/ml）：木瓜蛋白酶 0.86，DTT 1.5，白蛋白2.0。酶Ⅱ（mg/ml）：胶原酶 1.24，透明质酸酶 1.5，白蛋白 1.5分别用无钙台式液溶解于小瓶内。白蛋白，胶原酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、DTT 、Kaspartate、HEPES、amphotericinB、UTP、U73122、caffeine、ryanodine、 charybdotoxin均购自Sigma公司，bisindolymaleimide(BisI)购自Calbiochem公司，余为国产分析纯。ryanodine、BisI及amphotericinB溶于二甲亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)后，再加入实验浴液中使药物达实验所需浓度。浴液中DMSO终浓度<0.2%(vol/vol)。实验中已证实0.3%的DMSO本身对电流无明显影响。

　　1.2 猪冠状动脉平滑肌细胞急性酶分离

　　参照文献〔6〕所报道的方法并进行改良。在屠宰场处死猪后，迅速取出心脏并用生理盐水冲洗淤血，冷冻保存后立即送往实验室。剪下其左前降支及旋支，将剪下的动脉血管放入盛有溶液Ⅰ的器皿中，除去内外膜，再剖开血管，将血管斜行剪成2 mm×5 mm的条块。将组织块放入酶液，在37℃恒温水浴箱内振荡消化30～50 min左右，在此过程中每隔2～3 min取一块组织块放入含有溶液2的不同小瓶中，用玻璃吸管轻柔地吹打组织块数次后吸一滴悬液滴在载玻片上置于显微镜下进行观察。当视野出现较多折光性好的光滑细胞时中止消化，取出剩余组织块放入含溶液2的小瓶中吹打后将细胞悬液滴在底部铺满小盖玻片的玻璃培养皿内，静置于4℃冰箱保存备用。选择贴壁好、折光性强、具有较强立体感、表面光滑的平滑肌细胞进行实验。

　　1.3 穿孔电极液的配制

　　根据文献报道〔7〕，利用两性霉素进行穿孔，需预先配置贮备液：取两性霉素5 mg 加入25 μl DMSO，在超声波振荡器中超声震荡助溶，贮备液在-20℃低温保存备用。实验前取5 μl加入5 ml不含两性霉素的电极液中，使其终浓度为200 g/ml，DMSO在电极液中的浓度为0.1%。整个配制过程要避光。

　　1.4 全细胞STOCs的记录

　　取酶分离后8 h内冠脉平滑肌细胞，在室温(25℃)下进行实验。借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极入浴液，调节电极补偿旋钮，补偿电极-液界电压至0；推进电极接近细胞，当微管电极尖端(充灌电极液后阻抗2～3 MΩ)轻触细胞后，向微管电极内施以负压，使微管电极尖端内与周围细胞间形成电化学绝缘，阻抗约10～100 GΩ，高阻封接形成后利用穿孔剂在细胞膜上形成高离子通透性的小孔来构成通电性回路。一般在孔道完全形成，即获得全细胞构形后，补偿串联电阻使其最小，慢电容补偿后即可对细胞进行电压钳制。STOCs的记录方案：测试电位(test potential，TP)：-30 mV，脉冲时程100 s。刺激脉冲通过pClamp9.0软件控制的D/A转换器(Digidata 1322A，Axon Instruments)操纵，记录的信号经A/D转换后存入计算机硬盘。采样频率为10 kHz，低通滤波器的频率为2 kHz。穿孔膜片钳Rs＜30 MΩ，当电流＞200 pA时，需要调节串阻补偿。全细胞电容在本实验中部分补偿(40%～70%)。形成全细胞模式记录出通道电流后，稳定10 min，加入UTP，使其终浓度为50 μmol／L，观察UTP对STOCs的影响， 加药后5 min记录。分别用RyR抑制剂ryanodine（50 μmol/L）、PLC抑制剂U73122(5 μmol／L)和PKC抑制剂BisI (1 μmol／L)处理细胞，再观察UTP对STOCs作用的变化。

　　1.5 统计学分析

　　实验所得数据采用Mini Analysis 6.0 (Synaptosoft，software，Leonia，NF)软件进行分析处理，主要分析指标包括：电流幅值(amplitude)、电流频率(frequency)。结果以x±s表示，采用SPSS12.0软件进行统计学分析，实验结果组内自身前后对照采用配对t检验，组间对照采用两独立样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 STOCs的基本特性

　　本实验采用穿孔膜片钳技术记录急性酶分离的猪冠脉平滑肌细胞膜上的STOCs，并观察了其基本特性。

　　2.1.1 电流的电压依赖性随机性及变异性

　　TP为-30 mV，钳制时间(clamp time，CT)为100 s时，大约可在76%的细胞上记录到STOCs。TP-30 mV时记录到的STOCs增加和衰减极为迅速，大约持续100 ms，幅度大小不等，形状为不对称的钟形，相同幅度和不同幅度的STOCs可叠加形成不同形状的STOCs(图1A)。STOCs的出现具有随机性，且峰值幅度与频率均具有较大的变异性。STOCs也可出现在step和ramp方案引出的全细胞钾电流上(图1B、1C)。图2显示了典型的不同TP下(-50 mV～-10 mV)的 STOCs电流图形： -50 mV时STOCs仅有少数出现，且幅值和频率极小；随着去极化电压的增大，通道电流幅值和频率逐渐增加(n=5)。实验表明该电流具有明显的电压依赖性。

　　2.1.2 ChTX对STOCs的影响

　　浴液中加入BKCa通道的特异性阻断剂卡律蝎毒素(ChTX)，观察到200 nmol/L的ChTX可完全阻断记录到的外向电流(n=6)(图3)。提示实验记录的外向电流由BKCa通道所携带。

　　2.2 UTP对STOCs的作用

　　采用穿孔膜片钳技术，观察-30 mV测试电位下UTP对 STOCs的作用及RyR的特异性阻断剂ryanodine、PLC的特异性阻断剂U73122、 PKC的特异性阻断剂BisI对UTP作用的影响。

　　2.2.1 UTP对STOCs的作用

　　向浴液中加入UTP，使其终浓度为50 μmol/L，观察STOCs在加药前后电流幅度及电流频率的变化。加药前STOCs的电流幅度为（23.53±2.55）pA，电流频率为（0.216 7±0.021 7）Hz；加药后分别增加到（40.76±5.75）pA，（0.369 5±0.035 8）Hz(n=7，P<0.01)(图4A)，增加到加药前的（73.20±24.45）%和（58.88±18.41）%。条图显示了加入UTP后进行标准化处理的STOCs的幅度和频率变化(图4B)。

　　2.2.2 ryanodine对UTP作用的影响

　　加入UTP激活通道后再加入ryanodine可完全抑制UTP的激活作用（图5）。表明RyR在UTP对STOCs的激活中起重要作用。

　　2.2.3 U73122对UTP作用的影响

　　浴液中加入PLC的特异性阻断剂U73122 (5 μmol/L) 预处理细胞(10 min)，加入50 μm UTP后记录电流幅度及频率，与加入UTP前相比无明显变化〔（22.76±6.43）pA，（0.222 7±0.097 7）Hz vs（23.28±8.43）pA，（0.195 3±0.061）Hz；n=7，P>0.05〕(图6A)。提示U73122存在时，UTP无法发挥激活效应。条图显示了依次加入U73122和UTP后进行标准化处理的STOCs幅度和频率变化(图6B)。

　　2.2.4 BisI对UTP作用的影响

　　浴液中加入PKC的特异性阻断剂BisI (1 μmol/L) 预处理细胞（10 min）后加入50 μmol/L UTP可使STOCs的电流幅度及电流频率明显增加〔（46.32±6.17）pA，（0.407±0.061）Hz vs（65.53±8.34）pA，（0.693 7±0.059 7）Hz；n=10，P1<0.05，P2<0.01〕(图7A)。条图显示了依次加入BisI和UTP后进行标准化处理的STOCs幅度和频率变化(图7B)。为了进一步明确PKC的特异性阻断剂BisI对UTP激活作用的影响，比较UTP组与BisI+UTP组之间UTP对STOCs的作用，以UTP组为对照比较两组中STOCs幅度与频率的增加值，统计分析得出两者作用之间有显著性差异(见表1)。上述结果表明，当BisI存在时，UTP使STOCs幅度与频率的增加明显大于BisI不存在时。表1 BisI对UTP作用的影响（略）

　　3 讨论
　　
　　STOCs发生起源于BKCa通道激活，与胞膜上10～100个左右的BKCa通道的同步开放相一致，低频率的STOCs(1 Hz)即可明显影响膜电位。越来越多的研究表明由BKCa通道介导的STOCs在血管平滑肌的肌源性调节中发挥重要作用。本实验使用急性酶分离法获得的猪冠状动脉平滑肌细胞，采用全细胞穿孔膜片钳方式记录胞膜上的STOCs。实验中记录到的STOCs的特性与本实验室前期观察到的BKCa通道的单通道电流及全细胞电流具有明显的电压依赖性一致〔1，6，7〕，且对BKCa的特异性阻断剂ChTX敏感，提示记录到的电流由BKCa通道携带。
　　
　　实验中观察到UTP可增加STOCs的幅度与频率，RyR的特异性阻断剂ryanodine处理细胞后，UTP无法激活STOCs，此实验结果证实RyR在STOCs的产生中起重要作用，UTP可能通过某种机制作用于RyR进而激活STOCs 。较早White等〔8〕在大鼠胃平滑肌上的研究发现Carbachol可通过激活IP3R而触发RyR的开放。该结果与在平滑肌细胞〔9，10〕上得出的两种不同钙释放通道可相互作用而影响收缩因子激发的钙释放的结论相一致。本实验中用PLC的特异性阻断剂U73122预处理细胞后，UTP无法激活STOCs。提示：PLC参与了UTP对STOCs的激活过程。而PLC主要是通过水解PIP2生成DG与IP3而发挥生物学效应的。提示：UTP的PLCIP3通路在其中起了重要作用。另外，近年来对于RyR和IP3R的研究表明在一些细胞上，如神经细胞和平滑肌细胞，这两种受体可同时表达且具有相似的结构，起源于同一祖代钙释放通道，都对钙敏感且具有相似的钙敏感区域，因此两者之间可能存在时空联系，相互影响，共同调节血管的舒缩活动〔11〕。因此可进一步研究RyR和IP3R之间是否存在有交叉激活。
　　
　　实验中用PKC的特异性阻断剂BisI处理细胞后，加入UTP仍可激活STOCs，且激活效应明显强于UTP的单独作用。提示PKC抑制UTP的激活效应。当PKC被抑制后，其阻断作用亦被抑制，因此UTP的激活效应明显加强。提示UTP通过DGPKC激活PKC，而PKC在UTP对STOCs的调控中发挥了重要作用。PKC对于胞内钙瞬态及与之耦联的胞膜上离子通道的调控最早在动脉平滑肌上。最近的研究指出，在气道平滑肌上， PKC可通过与 RyR1间的相互作用而影响钙火花，从而进一步影响STOCs〔12〕。但也有学者认为PKC降低了BKCa通道的钙敏感性，从而降低局部钙瞬态与BKCa通道之间的联系。进一步研究表明BKCa通道的β亚单位在这一过程中起重要作用〔13，14〕，这也为今后的研究指明了方向。
　　
　　对心血管细胞信号转导的研究，不仅有助于阐明心血管功能的调节机制及心血管病的发病机制，还将为新药设计提供新思路和新的分子靶点。本研究提示UTP可激活猪冠状动脉平滑肌上的STOCs，PLC、RyR和PKC均参与了该过程，这为该领域的进一步研究奠定了基础。

参考文献

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