低重氢水对衰老小鼠脑组织氧化损伤的影响

　　　　 作者：李洁佳 朱俐 石仲瑗 骆倩倩 丛峰松

【摘要】 　　目的 探讨低重氢水对D半乳糖（Dgal）所致衰老小鼠脑组织氧自由基损伤的影响。方法 成年ICR小鼠随机分为正常对照组，衰老模型组和低重氢水组（n=10），低重氢水组小鼠给予低重氢水自由饮用，其余两组为普通饮用水。在第4周时，模型组及低重氢水组小鼠颈背部皮下注射Dgal 120 mg·kg-1·d-1，连续6 w，造成亚急性衰老模型。分别观察各组小鼠学习记忆能力的改变和脑皮层丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）及乳酸（LD）的含量和Na+K+ATP酶活力。结果 给予Dgal 6 w后，Y型电迷宫检测显示模型组72及96 h的正确反应率均明显低于对照组（P<0.05），但低重氢水组与模型组相比没有明显差异。生化检测显示，模型组脑皮层的 MDA及LD含量增高，GSH含量及Na+K+ATP酶活力降低，低重氢水能降低脑皮层中MDA及LD含量，显著提高GSH含量及Na+K+ATP酶活力。结论 低重氢水对Dgal所致衰老小鼠的脑组织氧化损伤具有一定的保护作用。

【关键词】 低重氢水；衰老；丙二醛 ；谷胱甘肽；乳酸；Na+K+ATP酶；Y迷宫；小鼠

　　生命机体对重氢无抵御能力，一旦进入生命体后代谢较缓慢，由于其在体内有蓄积作用，所以高含量的重氢对人体的遗传、代谢和酶系等均有不良影响。低重氢水（DDW）是采用同位素分离技术，降低自然界水中重氢含量的水。有研究报道，长期饮用重氢含量低的水可抑制动物恶性肿瘤的发展，并延长动物的寿命〔1〕。导致机体衰老的机制最为常见的是自由基学说，其观点是氧自由基对分子和细胞成分的损害可能导致细胞衰老和某些疾病的发生。在机体的衰老过程中，随着年龄的增长，自由基水平也随之增加，而体内清除自由基的防御机能则随之降低。因此本课题拟从自由基学说为出发点来研究DDW的抗衰老作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　30只癌症研究所啮齿类封闭屏障系统饲养（ICR）小鼠由南通大学实验动物中心提供〔动物合格证号：SYXK（苏）20070021〕，体重（20.0±2.0）g，雄性。

　　1.2 药品及试剂

　　DDW由上海交通大学生命科学技术学院提供，重氢含量为(50±5) ppm；D半乳糖（Dgal）购自美国Amerisco公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、乳酸（LD）、Na+K+ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 动物分组、造模及给药

　　取ICR雄性小鼠30只，随机分为3组：正常对照组（n=10)，衰老模型组（n=10）和DDW组（n=10），DDW组小鼠给予DDW自由饮用，其余两组为普通饮用水。在第4周时，衰老模型组及DDW组小鼠颈背部皮下注射Dgal 120 mg·kg-1·d-1，连续6 w，造成亚急性衰老模型。实验中衰老模型组死亡2只，DDW组死亡1只。

　　1.3.2 学习记忆能力检测（Y型迷宫法）

　　

参考文献

〔2，3〕并稍有改进，训练时将小鼠置于起步区，适应环境1 min，然后通电，按一定规律变换安全区和电击区。当小鼠进入安全区后，令其停留30 s，以巩固记忆。如此反复，以小鼠由起步区直接进入安全区为正确反应，反之为错误反应。连续20次电击，持续训练2 d，分别于72及96 h记录20次内正确反应率。

　　1.3.3 生化指标的测定

　　行为学测定结束后，断头处死小鼠，4℃生理盐水灌注15 min，取脑皮层加入预冷生理盐水进行匀浆，然后按试剂盒中提供方法测定脑皮层中MDA、GSH及LD的含量和Na+K+ATP酶的活力。

　　1.4 统计学方法

　　应用SPSS11.0统计软件，数据用x±s表示，采用方差分析，组间比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 DDW对Dgal衰老模型小鼠学习记忆功能的影响

　　衰老模型组于72及96 h均出现记忆能力下降，与正常对照组比较，差异显著（P<0.05）；而DDW对Dgal衰老模型小鼠学习记忆功能保护作用不明显。见表1。表1 DDW对Dgal衰老模型小鼠学习记忆功能的影响(略)

　　2.2 DDW对Dgal衰老模型小鼠脑内自由基相关指标的影响

　　与正常对照组相比，衰老模型组脑皮层的MDA及LD含量显著增高（P<0.05），而GSH含量与Na+K+ATP酶活力均明显降低（P<0.05）；DDW能降低模型鼠脑皮层中MDA及LD含量（P<0.05）；同时增加其GSH含量，并提高Na+K+ATP酶活力（P<0.05）。见表2。表2 DDW对Dgal衰老模型小鼠自由基相关指标的影响（略）

　　3 讨论
　　
　　Dgal在细胞内生成不能被进一步代谢的半乳糖醇，不断堆积导致渗透压增加，细胞肿胀，氧自由基增加，使细胞膜脂质受损，过氧化脂质、脂褐质等增高〔4〕，表现出与自然衰老动物相似的学习记忆能力下降，抗氧化酶活性降低，免疫功能退化等变化，所以已广泛用于药物抗衰老研究〔5〕。
　　
　　本实验发现Dgal诱导衰老模型小鼠学习记忆能力明显下降；另外MG组小鼠脑皮层中MDA含量及LD含量升高， GSH含量及Na+K+ATP酶活力降低。MDA含量反映了细胞受脂质过氧化损伤的程度，间接反映组织的损伤程度〔6〕。氧自由基导致线粒体细胞膜的不饱和脂肪酸链过氧化而断裂，使线粒体膜流动性下降，通透性增加，导致Na+K+ATP酶活力下降，自由基还会破坏线粒体克氏循环和电子传递链，抑制有氧呼吸形成大量的LD，Na+K+ATP酶活力和LD含量从侧面反映了细胞膜氧化损伤的程度〔7〕。GSH是一种非酶抗氧化剂，是体内所含的非蛋白巯基化合物数量最多和巯基数量最高的化合物，在整个机体氧化还原链中和维持机体内环境处于自稳态方面起关键性作用〔8〕。这些结果说明本文经Dgal处理脑组织存在着较严重的氧自由基损伤，且抗氧化能力下降，提示用Dgal诱导小鼠的衰老模型成功。DDW能使小鼠脑皮层中MDA含量及LD含量降低，GSH含量及Na+K+ATP酶活力升高，说明DDW可能通过减少组织中自由基产物，增加抗氧化物GSH的含量，从而减少细胞膜的脂质过氧化，发挥抗氧化、延缓衰老的作用。但是DDW对Dgal衰老模型小鼠的学习记忆功能的影响不明显，可能是因为记忆功能的变化是比较漫长的过程，而DDW主要是通过置换机体内重氢含量较高的水而起作用，其作用比较缓慢，所以由于DDW饮用时间较短（2个月），导致体内的生化指标虽然已经发生变化，但是还没有累积到行为学的差异。关于长期饮用DDW能否有效改善衰老动物的学习记忆，尚待深入研究，以期为进一步开发利用DDW提供更多的实验依据。

参考文献

　　1 Olgun A.Biological effects of deuteronation：ATP synthase as an example〔J〕.Theor Biol Med Model，2007；4:9.

　　2 王跃春.Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理运用〔J〕.中国行为医学科学，2005；14(1)：6970.

　　3 王跃春，王子栋，孙黎明，等.动物学习记忆能力的Y型迷宫测试法〔J〕.暨南大学学报(自然科学与医学版)，2001；22(5):13740.

　　4 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学〔M〕.北京:人民卫生出版社，2003:14646.

　　5 李文彬，韦丰，范明，等.D半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，1995；9（2）：935.

　　6 Chen CF，Lang SY，Zuo PP，et al.Effects of Dgalactose on the expression of hippocampal peripheraltype benzodiazepine receptor and spatial memory performances in rats〔J〕.Psychoneuroendocrinology，2006;31(7)：80511.

　　7 陈媛，周玫.自由基医学基础与病理生理〔M〕.北京:人民卫生出版社，2002：3685.

　　8 Peterson JD，Herzenberg LA，Vasquez K，et al.Glutathione level in antigenpresenting cells modulate Th1 versus Th3 response patterns〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95（6）:30716.