反义寡核苷酸和丙戊酸对心肌细胞肥大组蛋白脱乙酰基酶2的影响

【摘要】 　　目的 观察反义脱氧寡核苷酸和丙戊酸对大鼠心肌细胞肥大组蛋白脱乙酰基酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）表达的影响。方法 常规方法培养原代心肌细胞，利用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激心肌细胞制造心肌细胞肥大模型，应用HDAC2反义脱氧寡核苷酸和丙戊酸进行干预。给予AngⅡ 12 h和24 h后进行逆转录聚合酶链反应（RTPCR）观察HDAC2 mRNA表达；通过相差显微镜观察心肌细胞的面积；利用免疫组织化学法检测心肌细胞HDAC2蛋白的表达。结果 与正常对照组相比，肥大组心肌细胞面积增加，HDAC2 mRNA和蛋白表达均增加。与肥大组相比，HDAC2反义脱氧寡核苷酸组和丙戊酸组的心肌细胞面积均减小（P＜0.05，P＜0.05），HDAC2 mRNA和蛋白表达亦减少（P＜0.05，P＜0.05），但仍高于正常对照组（P＜0.05，P＜0.05）。结论 体外AngⅡ致心肌细胞肥大过程中伴有 HDAC2的mRNA和蛋白表达增加，应用HDAC2反义脱氧寡核苷酸和丙戊酸后可使之下降，表明HDAC2在心肌细胞肥大中发挥着促进作用。

【关键词】 组蛋白脱乙酰基酶2；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞；肥大；反义脱氧寡核苷酸

　　心肌细胞肥大是一种复杂的、多种因素参与调节的动态过程，包括血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）在内的多种化学因素、多种机械刺激的作用都有可能导致心肌细胞的肥大。尽管对于其中的内在机制尚未完全明确，目前认为在心脏肥大的细胞信号传导通路中，组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs）可能是一个重要的终极靶点〔1〕。HDACs分为三类，其中Ⅰ类HDACs被推断认为有可能对于心肌肥厚发挥着促进作用，但目前有待于进一步明确〔2〕。本课题组以Ⅰ类HDACs之一——组蛋白脱乙酰基酶2(HDAC2）为着眼点，以AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大，给予HDAC2反义脱氧寡核苷酸和HDACs抑制剂——丙戊酸进行干预。通过观察HDAC2在这一过程中的变化，以求证其对心肌细胞肥大的促进作用；同时也可证明丙戊酸作为临床上常用的一种抗癫痫药物，对于心肌肥厚有一定的抑制作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　新生1～3 d Wistar乳鼠，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM，美国Hyclone公司。兔多克隆抗体人HDAC2（H54）及羊抗兔抗体，美国Santa Cruz公司产品。丙戊酸钠，美国Sigma公司。二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂，TakaRa公司。相差光学显微镜，Nikon eclipse ts100。紫外透射检测分析仪FS312，上海复生生物工程研究所。RTPCR引物和HDAC2错义脱氧核苷酸序列由北京奥科公司合成。FuGENE 6，瑞士Roche公司。

　　1.2 FuGENE 6转染反义脱氧寡核苷酸

　　按照FuGENE 6说明书进行操作。于无菌试管中预先放入97 μl无血清培养液，加入FuGENE 6 3 μl，室温下孵育5 min。加入HDAC2反义脱氧寡核苷酸 2 μg形成混合物，混匀后均于室温下孵育30 min。反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN)序列为5′GATGGGAAGGAGAGCAGCACAG3′。

　　1.3 心肌细胞培养

　　取新生2～3 d Wistar乳鼠心脏，放入含无血清DMEM培养液的平皿中。去除心房心包膜及附属大血管后，0.25%胰酶反复消化、取上清，将收集的上清液用2 000 r/min离心10 min。弃上清，在离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，将细胞重悬，细胞计数。按细胞数2×105/ml接种于6孔板培养。细胞分为正常对照组、肥大组、反义组和丙戊酸组。肥大组、反义组和丙戊酸组均加入10-5 mol/L AngⅡ，AngⅡ终浓度为2×10-7 mol/L；反义组加入于上述HDAC2反义脱氧寡核苷酸混合物；丙戊酸组加入丙戊酸，其终浓度为10-3mol/L；正常对照组仅加入等量无血清培养液。加入AngⅡ后12 h和24 h进行以下检测。

　　1.4 相差显微镜下观察细胞面积变化

　　各组均随机选取10个视野，每个视野随机选取10个心肌细胞，在1 600倍下应用Motic Images 1.3软件测量心肌细胞面积，计算平均值。

　　1.5 RTPCR检测HDAC2 mRNA表达

　　以Trizol (Invitrogen公司产品)提取心肌细胞中的总RNA，用紫外分光光度计测总RNA纯度和含量，按照TaKaRa RTPCR试剂盒说明书进行操作。HDAC2基因引物序列：上游：5′GCT CGA TGT TGG ACG TAT GAG AC3′；下游：5′ACC TCC TTC ACC TTC ATC CTC AG3′；扩增片段长度为364 bp。βactin基因引物序列：上游：5′TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG3′；下游：5′GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG3′；扩增片段长度为764 bp。逆转录条件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，4℃ 贮存。PCR反应条件：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共进行30个循环；72℃ 7 min，4℃贮存。PCR产物经1%琼脂糖电泳，经紫外透射分析拍摄电泳条带。以βactin为内参照，结果以HDAC2/βactin比值表示。

　　1.6 免疫组化法检测HDAC2蛋白表达

　　取出各组无菌细胞培养玻片，无菌冷丙酮固定20 min。置于0.3% h3O2中30 min抑制内源性过氧化物酶。加入一抗(兔多克隆HDAC2抗体)4℃过夜。加入二抗（羊抗兔抗体），室温下2 h。DAB显色。苏木素复染。乙醇脱水，二甲苯脱乙醇，封片。镜下观察，HDAC2以细胞核棕黄色为阳性。采用镜下随机选取10个视野，分别计算HDAC2表达阳性心肌细胞的百分数。

　　1.7 统计结果

　　数据以x±s表示，采用SPSS 12.0软件包进行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 心肌细胞面积的改变

　　在1 600倍下，正常对照组、反义组和丙戊酸组心肌细胞面积在12 h、24 h点均低于肥大组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但反义组和丙戊酸组心肌细胞面积仍高于对照组（P＜0.05）。反义组和丙戊酸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。表1 各组心肌细胞面积的检测（略）

　　2.2 HDAC2 mRNA表达检测结果

　　正常对照组、反义组和丙戊酸组心肌细胞HDAC2 mRNA表达在12 h、24 h点均低于肥大组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但反义组和丙戊酸组仍高于对照组（P＜0.05）。反义组和丙戊酸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。表2 各组心肌细胞HDAC2 mRNA的表达(略)

　　2.3 HDAC2蛋白表达

　　正常对照组、反义组和丙戊酸组心肌细胞HDAC2蛋白表达在12 h、24 h点均低于肥大组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但反义组和丙戊酸组仍高于对照组（P＜0.05）。反义组和丙戊酸组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。表3 各组心肌细胞HDAC2蛋白检测结果(略)

　　3 讨论
　　
　　蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种重要形式，通过乙酰化或去乙酰化，可以改变染色质的结构或者是转录因子的活性，从而可以调节基因转录的活性。真核生物染色质的基本单位——核小体是由核心组蛋白和DNA组成，核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化是基因表达过程中重要的调控方式之一〔3〕。催化组蛋白去乙酰化的酶组蛋白脱乙酰基酶分为三类，这三类HDACs中，仅前两类与核心组蛋白的去乙酰化相关，Ⅲ类HDACs则无此作用，因此目前认为仅前两类参与对基因转录的调节〔4，5〕。研究结果显示Ⅱ类HDACs在心肌细胞肥大过程中发挥一定的抑制作用〔2，6〕，并推断Ⅰ类HDACs发挥着促进作用〔7〕。本实验结果证实了Ⅰ类HDACs在这一过程中有一定的促进作用，与其他学者在大体动物实验中的研究结果是一致的〔8〕。
　　
　　目前对于HDAC2在心肌细胞肥大过程中发挥促进作用的具体机制尚未完全明确，结合其结构特点以及先前研究结果推测，HDAC2对基因转录的调节作用可能是通过参与辅阻遏物的形成而实现的。在辅阻遏物mSin3中，主要成分包括核受体辅助抑制因子(NcoR)、甲状腺沉默介导因子(SMRT)、Sin3、组蛋白去乙酰化酶(HDAC2)。该复合物与核受体、Mad/Max等转录因子结合，并且通过Sin3募集HDAC2到特定基因的调控区，通过对组蛋白去乙酰化而发挥抑制作用。另外，HDAC2与一种特殊的心脏特异性基因转录调节因子——Hop蛋白（Homeodomain only protein）有着密切关切〔7〕。具体内在关联尚有待于深入研究。
　　
　　另外，本文结果表明了HDAC2反义脱氧寡核苷酸和HDAC抑制剂对于心肌细胞肥大的抑制作用。丙戊酸是20世纪70年代开始应用于临床的一种广谱抗癫痫药，多年的临床实践证实了丙戊酸的良好耐受性。其治疗癫痫的作用机制为增强γ氨基丁酸(GABA)的抑制作用，稳定膜的兴奋性，主要用于各种类型的癫痫发作，亦可用于癫痫持续状态。但是直到近些年才发现丙戊酸还是一种选择性Ⅰ类HDACs抑制物，而且这一抑制作用与其治疗性抗癫痫作用不同。其对心脏肥大的抑制作用有着重要的意义，对于这方面的研究有必要进一步从临床研究的角度加以证实。

参考文献

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