高脂膳食对小鼠学习记忆能力和突触可塑性的影响

　　　　 作者：任姗姗 贺晓娟 云少君 张淑华 肖忠新 魏守刚

【摘要】 　　目的 探讨高脂膳食对学习记忆及突触可塑性的影响，为合理膳食预防脑老化提供科学依据。方法 雄性ICR小鼠分为4组，即高脂膳食组、脑老化组、模型组、普通对照组，每组10只。以每天D半乳糖100 mg/kg皮下注射法制备脑老化模型，实验干预期共9 w。以Morris水迷宫测试小鼠空间记忆和学习能力，流式细胞术测定皮层海马神经元突触体数量，荧光偏振法测定突触体膜流动性。结果 ①水迷宫实验中，脑老化组小鼠的逃避潜伏期 (EL) 明显大于普通对照组小鼠(P<0.05)，模型组小鼠的EL与脑老化组无显著差异(P>0.05)，高脂膳食组与普通对照组小鼠的EL无显著差异(P>0.05)。②突触体数量：脑老化组和模型组小鼠低于非脑老化组(高脂膳食组和普通对照组，P<0.05)，模型组与脑老化组之间无显著差异(P>0.05)，但高脂膳食组显著低于普通对照组(P<0.05)。③突触体膜流动性：脑老化组和模型组小鼠显著低于普通对照组(P<0.05)。脑老化组和模型组之间无显著差异(P>0.05)。高脂膳食组显著低于普通对照组(P<0.05)。结论 高脂膳食可使小鼠皮层海马突触体数量减少，突触体膜流动性降低，但对小鼠学习记忆能力未见明显影响，对D半乳糖诱导的脑老化也无明显协同效应。

【关键词】 高脂膳食；脑老化；突触可塑性；膜流动性

　　【Abstract】 Objective To examine the effects of high fat diet on learning as well as on synaptic plasticity and afford scientific evidence to rational diet and prevent brain aging. Methods Forty male ICR mice were randomly pided into the high fat diet only， the Dgalactoseinduced brain aging， brain aging plus high fat diet， and normal control groups. Mice were given 100 mg·kg-1·d-1 subcutaneous injection of Dgalactose to prepare brain aging model for 9 w. Morris water maze (MWM) test was employed to determine their spatial learning and memory abilities. Flow cytometry (FCM) was used to analyze the amount of hippocampal synaptosomes. Membrane fluidity of synaptosomes was measured by fluorescence polarization technique. Results (1)In Morris water maze test， brain aging mice showed a significanly longer escape latency (EL) than that of the normal control mice (P＜0.05). There was no statistical difference in EL between brain aging mice plus high fat diet and brain aging mice groups (P＞0.05)， and between the control and high fat diet groups (P＞0.05). (2)Number of synaptosomes: The number of synaptosomes in brain aging mice and brain aging mice plus high fat diet groups were less than those in nonbrain aging mice (the high fat diet and the control mice groups) (P＜0.05). There were no statistical difference in the number of synaptosomes between brain aging mice plus high fat diet and brain aging mice groups(P＞0.05). The high fat diet group was less than that of the normal control group (P＜0.05). (3)Membrane fluidity of synaptosomes: The fluidity of membrane in brain aging group and brain aging mice plus high fat diet group were less than that in the control group (P＜0.05). There were no statistical difference between brain aging mice plus high fat diet groups and brain aging mice group (P＞0.05). The high fat diet group was less than that of the normal control group (P＜0.05). Conclusions High fat diet can reduce the number and the fluidity of hippocampal synaptosomes in mice. But high fat diet has no significant influence on learning and has no significant synergism effects on the Dgalactoseinduced brain aging.
　　
　　【Key words】 High fat diet; Brain aging; Synaptic plasticity; Membrane fluidity
　　
　　大脑皮层和海马是学习记忆功能相关脑区，研究发现，衰老时该区域突触形态结构和数量发生变化，包括突触密度减少、突触界面曲率降低、间隙宽度加大和变宽、突触后致密物质变薄、突触体膜的流动性降低以及突触素含量减少等，这些变化可引起学习记忆功能障碍〔1〕 。阿尔茨海默病(AD)常被认为是一种加速的脑老化，患者学习记忆功能障碍的机制之一是海马神经元的突触丢失和突触可塑性的变化〔2〕。膳食脂肪的摄入量与认知功能及某些神经系统疾患密切相关，例如高脂膳食增加AD和其他类型痴呆发生的危险性〔3，4〕。本研究以D半乳糖脑老化小鼠模型为阳性对照，探讨髙脂膳食对大脑突触可塑性相关指标的影响，为合理膳食抗脑老化提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及其处理

　　3月龄清洁级雄性ICR小鼠40只，体重30～45 g，由首都医科大学实验动物中心提供，自由摄食和饮水。适应性饲养1 w后，将小鼠按体重随机分为4组，即脑老化组、模型组、高脂膳食组、普通对照组，每组10只。脑老化模型构建：以D半乳糖100 mg/kg 颈背部皮下注射，1次/d，连续9 w。高脂膳食干预：相关小鼠饲以特制高脂饲料，配方为基础饲料79%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇1%。其余饲养条件同普通对照鼠。

　　1.2 Morris水迷宫实验

　　完成9 w实验干预后进行Morris水迷宫（MWM）实验以检测小鼠的空间学习记忆能力，具体方法见文献〔5〕，共进行5 d，其间各组小鼠保持原干预措施不变。

　　1.3 突触体流式计数

　　参照文献〔6〕，稍作改动。小鼠断头处死，迅速取大脑皮层及海马，清洁称重，用预冷的0.32 mol/L蔗糖液（pH7.0）制成10%匀浆，离心10 min，取上清液铺加在1.2 mol/L冷蔗糖液表面，50 000 r/min离心15 min，小心取出突触体层带，按1∶3的比例用0.32 mol/L冷蔗糖液稀释。稀释液缓慢铺加在0.8 mol/L冷蔗糖液表面，50 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀即为突触体。用Na介质（NaPSS）缓冲液1 ml悬浮突触体，考马斯亮蓝法（Bradford）测定突触体悬液蛋白质浓度，调整蛋白浓度在120～200 mg/L，4°C保存。取突触体悬液100 μl，以突触泡膜素为一抗，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠单克隆抗体为二抗，对突触体进行免疫荧光间接染色，基本步骤为：固定液4℃固定2 h，一抗工作液4℃孵育1.5 h，FITC荧光标记二抗工作液4℃孵育1.5 h。洗涤液洗涤2次，离心5 min，适量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬浮，流式细胞仪(FCM)计数。

　　1.4 突触体膜流动性测定

　　采用荧光偏振法〔7〕。取突触体悬液500 μl，加入等体积20 μmol/L荧光探针1，62苯基1，3，5乙三烯（DPH）工作液，37℃避光孵育15 min，4℃，13 000 r/min离心2 min，沉淀重悬浮于NaPSS液中，37℃均衡10 min，用荧光分光光度计测荧光偏振强度。激发光波长360 nm，发射光波长430 nm。先用无标记对照突触体悬液测定I90°，0°和I90°，90°的荧光光度值，计算荧光偏振校正因子，然后测样品I90°，0°和I90°，90°，计算样品突触体膜偏振度和膜黏滞度η，蛋白浓度测定采用Bradford法。
1.5 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，多组均数间比较采用OnewayANOVA分析，两两比较采用最小显著差法(LSD)检验。

　　2 结果

　　2.1 突触体计数和突触体膜流动性

　　脑老化组和模型组突触体数量显著低于非脑老化组(高脂膳食组和普通对照组，P<0.05)，模型组的突触体计数与脑老化组无显著差异(P>0.05)。高脂膳食组突触体数量显著低于普通对照组(P＜0.05)。脑老化组及模型组突触体膜黏滞度显著高于普通对照组(P<0.05)，但与脑老化组及高脂膳食组之间突触体膜黏滞度无显著差异(P>0.05)。高脂膳食组显著高于普通对照组(P<0.05)。见表1。表1 高脂膳食对脑老化小鼠脑突触体计数和突触体膜流动性的影响(略)

　　2.2 MWM结果

　　脑老化组小鼠的逃避潜伏期（EL）显著高于普通对照组(P<0.05)，模型组EL显著高于普通对照组和高脂膳食组(P<0.05)，而与脑老化组无差异(P>0.05)，高脂膳食组与普通对照组之间EL亦无差异(P>0.05)。

　　3 讨论
　　
　　脑组织由于代谢水平高而自身抗氧化能力弱，易受活性氧自由基损害，根据老化的自由基理论，通过注射D半乳糖可使动物产生过量氧自由基而诱导发生脑老化，以此形成的脑老化动物模型已被用于老化和抗老化研究。本研究以D半乳糖诱导的脑老化小鼠为实验模型，通过Morris水迷宫测试，证实其学习记忆能力明显受损，表明脑老化模型建立成功。但模型组EL与脑老化组无差异，表明高脂膳食并未使脑老化小鼠学习能力进一步受损。高脂膳食对正常小鼠的学习能力也无明显影响。这与有关文献报道〔8〕的结果不一致，分析可能与本研究所采用的高脂饲料中添加了蛋黄粉有关。蛋黄粉中含有丰富的卵磷脂和维生素A等脑营养成分。
　　
　　本研究发现，D半乳糖诱导的脑老化小鼠大脑神经元突触体形成数量减少，突触体膜流动性降低，表明该脑老化模型小鼠有神经突触的丢失，突触细微形态结构的变化和突触功能下降。脑老化的一个基本表现是学习记忆能力的衰退，学习记忆的基础是神经系统的高度可塑性。突触是实现脑功能的关键部位，其可塑性代表了整个神经回路的可塑性。突触可塑性包括突触传递可塑性、突触发育可塑性和突触形态（包括突触丢失和新的突触联系的形成）的可塑性〔9，10〕。本研究所检测的小鼠的皮层和海马的突触体数量和突触体膜流动性均为突触可塑性相关指标〔9，10〕。突触体形成的数量一定程度上可反映神经元突触连接的多少，突触体膜的流动性则可反映突触传递功能。老年鼠大脑突触体膜胆固醇含量较年轻鼠显著增高〔11〕，而膜中胆固醇含量增加，特别是胆固醇与磷脂比例增加，可引起细胞膜流动性下降〔12〕。皮层和海马神经细胞膜的胆固醇含量较其他脑区高。因此，在脑老化过程中，皮层、海马神经元的膜流动性最易受到影响。本研究采用的D半乳糖脑老化模型，主要基于脂质过氧化损伤机制，研究表明同样能够造成大脑突触体形成数量减少和突触体膜流动性下降，但高脂膳食并未使D半乳糖的这种不良效应进一步加重，原因可能在于高脂膳食本身也是主要通过引发过氧化反应而损害脑功能，两种因素通过同一种机制影响突触可塑性，使其协同效应相对不明显。
　　
　　本研究发现，尽管高脂膳食并未明显影响正常小鼠的学习记忆能力，但却已导致正常小鼠突触体数量衰减和突触体膜流动性下降，说明高脂膳食对突触可塑性有确实的影响，另一方面说明学习记忆能力并不单纯依赖于突触可塑性。本文关于高脂膳食对脑老化小鼠和正常小鼠突触可塑性影响的研究结果提示，预防脑老化不仅是在老年期，更根本的措施应该是在各个年龄阶段均保持良好饮食习惯，避免长期高脂膳食。

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