腹腔内注射腺苷对大鼠海马区cfos表达的影响

　　　　 作者：付立波 王学斌 刘凤莲 宋迎

【摘要】 　　目的 研究腹腔内注射腺苷对大鼠海马区cfos蛋白表达的影响。方法 腹腔内注射腺苷和其非特异性受体阻断剂茶碱，采用Fos免疫组织化学染色(ABC法)，观察cfos蛋白在海马区内的分布情况。结果 注入腺苷后大鼠海马区的cfos蛋白表达与注入生理盐水相比明显增加，注入茶碱后大鼠海马区的cfos蛋白表达与对照组相比无显著变化。结论 腺苷能促进海马区cfos蛋白的表达，腺苷在海马区内对调节睡眠可能有重要作用。

【关键词】 腺苷；海马区；cfos；免疫组织化学染色法

　　腺苷（Adenoisine，Ado）作为中枢神经系统（CNS）的一种神经调质，可降低CNS神经元的兴奋性，在中枢许多部位具有抑制作用〔1，2〕 。Ado在CNS中直接或间接参与睡眠、镇静和镇痛等作用，是重要的睡眠调节因子之一。在缺血、缺氧和血流灌注不足的情况下，大脑中的Ado浓度迅速上升，内源性Ado对代谢增加和能量不足引起的组织损伤具有保护作用，对睡眠具有促进作用。许多睡眠因子，如白介素（IL）1，褪黑素等，通过使CNS内cfos蛋白及cfos mRNA表达水平提高促进睡眠〔3〕。海马区是重要的中枢部位，cfos基因在海马组织受到轻微刺激时就能表达。本实验采用腹腔内注射Ado和免疫组织化学方法，观察Fos蛋白在海马区的分布情况，为进一步明确Ado在大鼠海马区对睡眠的调节提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂

　　采用200～250 g雄性纯种Wistar大鼠30只(由吉林大学动物实验中心提供)，随机分三组，每组8只，即注入Ado组、注入茶碱组和注入生理盐水组（对照组）。每日对大鼠进行3次抓拿训练，连续训练1 w，以减少大鼠对抓拿反应的影响。
　　
　　Ado、茶碱由Sigma公司提供；过氧化酶阻断剂、非免疫动物血清、氧化酶阻断溶液、兔抗人cfos多克隆抗体、50 μl生物素、50 μl链霉菌抗生物素均由福州迈新生物技术开发有限公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 装片制备

　　将分组后的大鼠分别注入相应药剂，注入时间为1 h，然后立即将大鼠麻醉，随即开胸，经左心室灌注生理盐水100 ml，继以灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）500 ml进行固定，60 min后断头，取出脑组织，置于含4%多聚甲醛的PBS（0.1 mol/L）中后固定2 d，取相应海马区的脑组织块，用石蜡包埋，修块，并用LKBⅢ型超薄切片机切成 5～8 μm切片。

　　1.2.2 Fos免疫组织化学染色(ABC法)

　　将石蜡切片脱蜡和水化，之后用PBS（0.01 mol/L，pH7.4）冲洗3次，每次3 min。在每张切片上加一滴过氧化酶阻断剂（试剂A），即用抗原修复液对组织抗原进行修复，室温下孵育15 min。取出切片， 每张切片加50 μl过氧化酶阻断溶液（抗体），室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。甩去PBS，每张切片加50 μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育30 min。 除去血清，每张切片加50 μl的兔抗人cfos多克隆抗体，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3～5 min。除去PBS，每张切片加50 μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。 除去PBS，每张切片加50 μl链霉菌抗生物素过氧化酶溶液（试剂D），室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。 除去PBS，每张切片加100 μl新配制的二氨基联苯胺（DAB）溶液，观察3～10 min。自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

　　1.2.3 结果判断

　　细胞质中有红色颗粒者为阳性细胞，每只大鼠随机取5张切片，在400倍镜下计数核团内一个视野的Fos免疫反应阳性神经元（foslike）的数量，取其平均数。在观察切片时，每张切片计数3个高倍镜视野。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS11.0软件进行分析，计量数据以x±s表示，两组间均数用配对样品t检验进行显著性比较。

　　2 结果
　　
　　大鼠腹腔内注入Ado后，海马区内cfos蛋白表达为28.6%±8.37%，而注入生理盐水组cfos蛋白表达为16.4%±6.23%，二者相比统计学差异极显著（P<0.01）；腹腔内注入茶碱后海马区内cfos蛋白表达为17.3%±9.49%，与注入生理盐水组相比无统计学差异（P>0.05）；注入Ado组cfos蛋白量与注入茶碱组相比，统计学差异极显著（P<0.01），表明大鼠腹腔内注入Ado后cfos蛋白表达明显增加，注入茶碱后cfos蛋白表达增加不明显，即Ado促进cfos蛋白表达。见图1。

　　3 讨论
　　
　　Ado的生理作用广泛，且与其介导的受体有关。Ado受体有A1R、A2AR、A2BR、A3R等几种主要类型，其中在CNS内具有睡眠调节作用的受体主要是A1R、A2AR〔4〕。实验证明，睡眠剥夺后脑内Ado含量越来越高，一旦进入睡眠状态Ado浓度会很快下降。有研究表明，睡眠剥夺后大鼠前脑基底部细胞外Ado浓度升高，同时伴随着A1R mRNA升高，且在前脑基底部输注Ado可以增加睡眠，说明Ado具有促睡眠作用，并且与A1R激动相关〔5，6〕。根据李云庆等〔7〕的研究报道可以知道Ado通过与Ado A1R结合，经过钙离子依赖的蛋白激酶C转导途径抑制γ氨基丁酸（GABA）神经元，GABA的释放减少，cfos蛋白表达增加，促进睡眠。本实验表明：腹腔内注射Ado后海马区cfos表达明显增加，与腹腔内注射Ado促进大鼠缰核cfos的表达增加〔8〕相一致。
　　
　　海马结构和功能的研究一直受到关注，但其具体的功能及机制仍模糊不清。组织学研究发现脑内有兴奋性L谷氨酸能及抑制性GABA能神经纤维投射到海马〔9〕。研究发现，防卫性的应激反应能诱导海马部位产生cfos基因表达，而且发现对刺激产生反射错误较多的小鼠海马部位cfos基因表达明显高于产生错误少者〔10，11〕，提示海马部位cfos基因的表达与智力及本能反射有关。本实验表明：大鼠腹腔内注射Ado后，海马区内cfos蛋白表达增加，这与海马区注入Ado使睡眠增加相一致，进一步验证了Ado在海马区内具有促进睡眠的作用。
　　
　　一些对大鼠海马神经元具有营养作用的细胞因子如白细胞介素(IL)1β、IL2、IL6等能诱导体外培养的神经胶质细胞产生fos 蛋白，证明cfos 基因的表达是这些因子发挥作用的中间过程，fos 蛋白可能在外界刺激转录耦联的信使传递中起着核内第3信使的重要作用〔12〕。

参考文献

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　　2 Eckerle LG，Lucassen M，Hirse T，et al.Porther cold induced changes of adenosine levels in common eelpout (Zoarces viviparus):a role in modulating cytochrome c oxidase expression〔J〕.J Exp Biol，2008;211（8）:12629.

　　3 Ticho SR，Radulovacki M.Role of adenosine in sleep and temperature regulation in the preoptic area of rats〔J〕.Pharmacol Biochem Behav，1991；40(8)：3340.

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　　6 Reboal N，Rodrigues RJ，Lopes LV，et al.Adenosine A1 and A2A receptors are coexpressed in pyramidal neurons and colocalized in glutamatergic nerve terminals of the rat hippocampus〔J〕.Neuroscience，2005；133(1)：7983.

　　7 Li H，Wu L，Li YQ.Adenosine suppresses GABA A receptormediated responses in rat sacral dorsal commissural neurons〔J〕.Auton Neurosci，2004；111（2）：719.

　　8 付立波，王学斌，刘凤莲.腺苷对大鼠缰核神经元自发放电活动及cfos 蛋白表达的影响〔J〕.中国免疫学杂志，2010；26（2）：1415.

　　9 Anokhin KV， Ryabinin AE，Sudakov KV.Expression of the cfos gene in the mouse brain during the acquisition of defensive behavior habits〔J〕. Neurosci Behav Physiol，2001；31(2)：1349.

　　10 Foster TC.Involvement of hippocampal synaptic plasticity in agerelated memory decline〔J〕.Brain Res Rev，1999;30(3)：23649.

　　11 Onoe H，Ueno R，Fujita L，et al.Prostaglandin D2，a cerebral sleepinducing substance in monkeys〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1988；85(11)：40826.

　　12 丁爱石，王福庄，黄燕华，等.rhIL1、rhIL2和rhIL6对体外培养海马神经胶质细胞cfos表达的影响〔J〕.神经解剖学杂志，1998;14(1)：6771.