脑脉通对骨髓干细胞动员保护大鼠脑缺血损伤的影响

　　　　 作者：李建生 刘敬霞 张新峰 任伟宏 田玉收 王丁超

【摘要】 　　目的 研究脑脉通对脑缺血大鼠骨髓干细胞动员 (BMSCs) 在血液和脑组织的变化及脑保护作用的影响。方法 大鼠随机分为假手术组、模型组、脑脉通组、动员组、脑脉通+动员组，线栓法制备MCAO动物模型。皮下注射人重组粒细胞集落刺激因子(rGCSF)；脑脉通灌胃用药。检测大鼠外周血WBC及CD34+、脑组织CD34+变化；观察神经功能和脑组织病理改变；测定脑组织含水量和脑梗死面积。结果 模型组大鼠外周血WBC(8.07±1.27)×109/L和CD34+细胞(3.17±0.75)个/μl增加，3 d达到峰值，各治疗组增加更为明显；联合组2和3 d外周血WBC、各时间点CD34+细胞均较动员组增加。各模型组大鼠脑组织CD34+表达增强，7 d达到峰值(33.04±2.62)个/μl；各联合组较动员组增强明显。各模型组大鼠神经评分降低、脑含水量增加、脑梗死面积增大、脑组织病理损伤明显，以7 d显著；动员组大鼠7和14 d的上述指标改善；各联合组较动员组的改善明显。结论 血液WBC数CD34+计数，脑组织、CD34+表达均显著显示，脑缺血可引起BMSCs进入外周血并向脑组织归巢，峰值时间存在差异；GCSF可使BMSCs分布增加；脑脉通使动员后血液和脑组织BMSCs增多、脑组织峰值时间延长，且使其脑保护作用增强。

【关键词】 脑缺血；脑脉通；粒细胞集落刺激因子；骨髓干细胞
　　
　　【Abstract】 Objective To explore the effect of Naomaitong on mobilization of bone marrow stem cells (BMSCs) in blood and brain tissue and the role in protecting brain in rats with cerebral ischemia. Methods Rats were randomly pided into different groups. Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was duplicated with nylon thread. Rats in groups of mobilization and model were administrated with rGCSF（10 μg·-1·d-1）through subcutaneous injection before 3 d and after 2 d of operation respectively， once a day. Naomaitong was used through intragastric administration. On 2， 3， 7 and 14 d after operation， rats blood were taken through abdominal aorta， then white blood cells (WBCs) and CD34+ cells in peripheral blood were determined. Expression of CD34+ cells in rats brain tissue were detected. Rats state， ratio of weight change and general neural function score (GNFS) and brain pathologic change were observed， and then rats brain water ratio (BWR) and cerebral infarction size (CIS) were measured. Results Rats mortality increased after operation and the decreases of weight on 7 d were more obvious. Compared to model groups， decreases of weight in treat groups abated. WBCs（8.07±1.27） and CD34+ cells（3.17±0.75） in peripheral blood in model group increased obviously and showed the highest level on 3 d after operation. Increases of WBCs and CD34+ cells in rats of treat groups were more obvious. In comparison with that of mobilization groups， rats WBCs on 2 and 3 d combination groups increased more significantly and CD34+ cells in each combination group were more higher. Expression of CD34+ cells in brain of rats in model groups increased and showed the highest level on 7 d （33.04±2.62）and the changes showed more obvious in each mobilization and combination group， especially in each combination group. Rats GNFS were lower in each model groups and BWR， CIS and brain pathologic increased obviously， especially on 7 d model group. The changes aboved improved significantly on 7 and 14 d mobilization groups. Compared to the changes in mobilization groups， the improvement in each combination group showed more obvious.Conclusions BMSCs could enter peripheral blood and move towards brain tissue after cerebral ischemia and the peak is different. rGCSF could make BMSCs increase both in peripheral blood and brain. Meanwhile， Naomaitong could increase BMSCs which are mobilized and make the peak of BMSCs in brain prolong， as well as enhance the protection against brain injury after cerebral ischemia.
　　
　　【Key words】 Cerebral ischemia; Rats; Naomaitong; GCSF; BMSCs

　　骨髓干细胞(BMSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的原始骨髓细胞，可分化为主要的几类神经细胞，被用于脑组织损伤的保护和修复〔1〕。因符合机体自身的反应性修复机制，方法简便、安全且可避免异基因移植的免疫排斥反应，BMSCs动员在脑缺血损伤的应用方面显示良好前景〔2，3〕。粒细胞集落刺激因子(GCSF)是BMSCs有力的动员剂，可使脑缺血损伤后外周血和脑组织的BMSCs增加，并使其保护脑组织的作用增强。中药在骨髓干细胞动员保护脑组织受损方面研究有待进一步探索。我们前期研究发现，中药脑脉通(由大黄、人参、川芎、葛根组成)可增强BMSCs移植后的脑保护作用〔4〕，本研究拟就其对BMSCs动员后的分布变化及抗脑缺血损伤作用的影响进行探讨，为中药在BMSCs动员治疗脑缺血方面的应用提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　SD大鼠，SPF级，雌雄各半，3～4月龄，体重(300±50)g，202只，由河南省实验动物中心提供〔合格证号：scxk(豫)20050001〕。

　　1.1.2 药物与试剂

　　人重组粒细胞集落刺激因子注射液(rGCSF，商品名瑞白，山东齐鲁制药厂，规格：150 μg/支)；荧光标记单克隆抗体CD34+ (Santa Cruz产品)；羊抗大鼠IgG生物素(BA1005)、柠檬酸盐缓冲液(AR0024)、正常山羊血清封闭液(AR0009)、DAB 显色试剂盒 (AR1022)均由武汉博士德生物工程有限公司提供；脑脉通颗粒 (出膏率15%，由大黄、人参、川芎、葛根组成；河南中医学院药物分析学科提供，5 g/袋)。

　　1.1.3 主要仪器

　　流式细胞仪(Beckman Coulter Epics，XL)；数码相机 (Sony Corpatation，Japan，型号：DSCF717 2002)；光学显微镜(Olympus optical Co.LTD，japan，型号：PM10AD)；透射电子显微镜(Hitachi，Japan，型号 H7500)；图像分析系统ImageProplus 5.1(Media Cybernetics Inc，USA，型号41N510044800)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组

　　大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、脑脉通组、动员组、脑脉通+动员组 (联合组)。假手术组10只大鼠，其余4组均为48只；后4组根据取材时间又分为2、3、7、14 d组，每组大鼠12只。

　　1.2.2 用药方案

　　分别于术前3 d和术后2 d给动员组、联合组大鼠皮下注射rGCSF(10 μg·kg1·d-1)；假手术组、模型组和脑脉通组大鼠皮下注射等容积的生理盐水，每天1次。假手术组、模型组、动员组分别于造模前4 d用生理盐水灌胃，脑脉通组和联合组以生理盐水制备的脑脉通悬浮液(40.5 mg/ml)灌胃(40.5 mg·100 g-1· d-1)，造模前加灌胃1次，术后每日灌胃1次，直至取材 (灌胃容积为1 ml·100 g-1·d-1)，每周根据大鼠体重调整灌胃药物的用量和灌胃体积〔5〕。各组大鼠均于术前禁食12 h，不禁水。

　　1.2.3 模型制备

　　参照改良的Longa法用线栓阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型 (MCAO)〔6〕。10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰卧位固定大鼠，行颈前正中切口，左侧钝性分离颈总动脉(CCA)；分离颈内外动脉，穿线备用，结扎翼颚动脉，于颈外动脉近动脉分叉处剪口，栓线穿入颈内动脉，缓慢推进，直至感觉有阻力为止，穿线成功后缝合皮肤。假手术组除不穿入栓线外，其余操作相同。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃，保持室温(26±1)℃。术后注射青霉素钠(1万U·100 g-1·d-1)，以防感染。

　　1.2.4 取材与标本处理

　　假手术组大鼠术后14 d取材，其余各组分别于术后2、3、7、14 d观察大鼠一般状况，大鼠称重，进行神经功能评测；麻醉大鼠，腹主动脉取血5 ml，注入EDTA3K试管，流式细胞仪测定血白细胞计数及CD34+细胞数量；4%多聚甲醛溶液经升主动脉进行灌注固定，取出全脑，4℃生理盐水冲洗3遍，除去积血，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑半球，弃去右侧，取左侧半球，从额极向后冠状切取脑组织3 mm，待测脑组织含水量；依次向后冠状切取脑组织1 mm，迅速投入备好的内盛2%的TTC溶液，37℃避光育孵30 min，然后用10%的甲醛固定15 min，观察染色效果，待测脑梗死面积；向后冠状切取2 mm厚的脑组织投入备好的内盛多聚甲醛的小瓶内固定，待做脑组织病理和免疫组化检测；其余标本液氮冷存。

　　1.3 测定指标

　　1.3.1 大鼠死亡率

　　对术后苏醒至取材时死亡和存活大鼠进行计数，计算各组(包括2、3、7、14 d 4个时间点)死亡大鼠只数与总体(造模后死亡与存活大鼠总只数)的比率。大鼠死亡率=(死亡只数/死亡与存活只数总和)×100%。

　　1.3.2 大鼠体重变化率

　　分别于术后2 d至取材时间在相应时间点大鼠称重，采集数据的时间点数分别为2 d组(1个)、3 d(2个)、7 d(3个)、14 d(4个)，计算公式为：体重下降率=(术前体重-术后体重)/术前体重×100%，体重增长率=(术后体重-术前体重)/术前体重×100%。

　　1.3.3 外周血WBC计数

　　抗凝血液20 μl用WBC稀释液稀释20倍，取20 μl入血细胞计数盘的计数室，静置3 min，待WBC下沉，在低倍镜下计四角四个大方格的有核细胞，4格总和乘以50则为每立方毫米的有核细胞计数。

　　1.3.4 外周血CD34+细胞计数

　　抽EDTAK3抗凝腹主动脉血1 ml轻摇混匀，然后按试管编号，取样本全血50 μl，加CD34荧光素5 μl，轻混，摇匀后避光置室温20 min，加溶血素250 μl，混匀，避光置室温10 min，加PBS液500 μl，混匀，避光置室温10 min，离心1 500 r/min 5 min，弃上清，每管加盐水1 ml混匀，应用流式细胞仪进行检测，计数CD34+细胞平均值(个/μl)。

　　1.3.5 脑组织CD34表达测定

　　石蜡切片脱蜡和水化，柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)微波加热修复，3%的过氧化物酶溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，每张切片加1滴非免疫性动物血清(10%正常山羊血清封闭液)，室温下孵育10 min后滴加第一抗体(荧光标记单克隆抗体CD34)，进行抗原抗体特异结合；滴加生物素标记的二抗 (羊抗大鼠IgG生物素)，室温下孵育30 min后再滴加链亲和素过氧化物酶；DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。将染色后的脑组织切片取梗死周围皮质，图像分析系统ImageProplus 5.1进行图像采集；每张切片随机选取缺血侧皮层5个视野，取均值进行统计；每幅图像采用盲法进行分析测量，设定图像分析系统的最大灰度份极为(Cmax)256，最大光密度值(Dmax)为2，测定阳性蓖达的面积密度(Area)和平均光密度(Density)，计算整合光密度(IOD)，以每视野阳性细胞的IOD值进行数据统计；阳性细胞个数越多、阳性反应的IOD越大，反应越强。
　　
　　1.3.6 神经功能综合评测

　　神经功能评测方法按文献〔7〕从自发运动、轻瘫实验、前肢运动功能检测、加强运动功能检测、痛觉、位置觉6个方面进行，总分为18分，症状越重，得分越少。神经功能定量评测时间在术后48 h以及术后每周进行。选择术后48 h神经功能缺失在12分以下者可进入下一阶段观察，12分以上者剔除。

　　1.3.7 脑组织含水量

　　对切取的脑组织迅速用电子天平称重(精确度为0.1 mg)，之后放入100℃干燥箱中干燥24 h，再次称重。脑组织含水量=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100％，以%表示。

　　1.3.8 脑梗死面积
　　
　　切取的脑组织用2% TTC染色，数码相机拍照，应用计算机图像分析系统测定和计算脑组织梗死面积。以梗死面积占总脑片面积(%)的百分比表示。

　　1.3.9 脑组织病理观察

　　常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，200倍光镜下观察半暗带、缺血中心区等神经细胞病理变化。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS11.0统计软件，对数据资料进行正态分布检验，符合正态分布者采用单因素方差分析，不符合正态分布者进行数据转化后比较，结果以x±s表示。

　　2 结果

　　2.1 术后大鼠生存状况观察

　　2.1.1 一般状况

　　术中大鼠呼吸、体温维持在正常生理范围，无明显活动性出血。术后大鼠死亡出现两个高峰，于术后2～3 d和7 d；术后7 d大鼠体重下降明显，7～14 d大鼠进食、饮水、活动及毛色光泽等明显好转，体重增加。
　　
　　2.1.2 大鼠死亡率

　　模型组大鼠死亡率(34.40%)较假手术组(10%)明显增高(Ρ<0.05)；与模型组比较，动员组死亡率(30.24%)无显著升高；联合组大鼠死亡率(25.71%)较模型组和动员组及脑脉通组(28.57%)有下降趋势，但无显著的统计学差异 (Ρ>0.05)。

　　2.1.3 大鼠体重变化率

　　与假手术组比较，模型组2、3和7 d大鼠体重下降显著，14 d增长减少(Ρ<0.01)；与模型组比较，脑脉通组和动员组7 d、联合组各时间点大鼠的体重下降减少，各组14 d的增加显著(P<0.05，Ρ<0.01)；联合组3和7 d较脑脉通组体重下降减少，14 d体重增加显著(P<0.01)，联合组7 d的大鼠体重下降也较动员组减少(P<0.05，Ρ<0.01)；模型组、动员组7 d大鼠体重下降率分别较其2和3 d组明显(P<0.05，Ρ<0.01)，见表1。表1 各组大鼠体重变化率比较(略)

　　2.2 各组大鼠外周血WBC计数的变化 模型2、3 d组大鼠外周血WBC较假手术组显著增多(P<0.01)。与模型组比较，脑脉通组、动员组和联合组各时间点的WBC计数均显著增多(P<0.05，P<0.01)。动员组各时间点外周血WBC计数均较脑脉通组增加(P<0.05，P<0.01)。联合组各时间点较脑脉通组、2 d和3 d动员组外周血WBC计数明显增加(P<0.05，P<0.01)。模型组、动员组和联合组3 d的外周血WBC计数分别较其2 d组增加，7 d和14 d较2 d组减少明显(P<0.05，P<0.01)；各组大鼠7 d和14 d的WBC计数均较其3 d组减少明显(P<0.05)，表2。表2 大鼠外周血WBC计数(109/L)及血液CD34+细胞计数(略)

　　2.3 大鼠外周血CD34+细胞计数变化

　　假手术组大鼠血液中有少量CD34+细胞。模型2、3 d组大鼠外周血CD34+计数均较假手术组显著增加(P<0.05)；与模型组比较，动员组2、3和7 d，联合组各时间点的大鼠外周血CD34+细胞计数显著增加(P<0.05，P<0.01)，以3 d组的增加尤为显著(P<0.01)。动员组各时间点外周血WBC计数均较脑脉通组增加(P<0.05，P<0.01)。联合组各时间点较脑脉通组、3和7及14 d较动员组外周血WBC计数明显增加(P<0.05，P<0.01)。各组3 d较其2 d组增加，14 d较其2 d组减少，动员组7 d的外周血WBC计数也较其2 d组减少(P<0.05，P<0.01)；各实验组7 d较其3 d组减少明显(P<0.05，P<0.01)；与7 d组比较，动员组和联合组14 d的WBC计数减少(P<0.05)，见表2。

　　2.4 大鼠脑组织CD34+表达变化

　　假手术组脑组织中未检测到CD34+细胞表达。模型组各时间点大鼠脑组织CD34+表达均较假手术组显著升高(P<0.01)。与模型组比较，脑脉通、动员组和联合组各时间点大鼠脑组织CD34+表达均显著增强(P<0.01)。各动员组大鼠脑组织表达均较脑脉通组显著增强(P<0.01)。各联合组大鼠脑组织CD34+表达分别较脑脉通组和动员组增强(P<0.05，P<0.01)。各实验组大鼠7 d的脑组织CD34+表达分别较其2和3 d组增强，14 d组较其2和3 d组减弱(P<0.05，P<0.01)；各组14 d的表达均较其7 d组减弱(P<0.01)，见表3。表3 各组大鼠脑组织CD34+细胞表达比较(略)
　
　　2.5 大鼠神经功能评分变化

　　各模型组大鼠神经功能评分均较假手术组显著降低，以7 d组尤为显著(P＜0.01)。与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点大鼠的神经功能评分均明显增高，动员组7和14 d的评分增加(P＜0.05，P＜0.01)。与脑脉通组比较，动员组2和3 d大鼠神经功能评分降低(P＜0.05)。联合组7和14 d大鼠神经功能评分分别较脑脉通组和动员组增高，以14 d组的增高尤为明显(P＜0.05，P＜0.01)。各实验组大鼠7和14 d的神经功能评分分别较其2和3 d组增加，脑脉通组和联合组3 d也较其2 d组增高(P＜0.05，P＜0.01)；各实验组14 d大鼠较其7 d组的神经评分增加显著(P＜0.01)，见表3。

　　2.6 大鼠脑组织含水量变化

　　各模型组大鼠脑组织含水量均较假手术组显著升高(P<0.01)。与模型组比较，脑脉通和联合组各时间点大鼠脑组织含水量降低，动员组7 d、14 d的脑含水量明显降低(P<0.05，P＜0.01)。动员组3 d的脑含水量较脑脉通组增多(P＜0.05)。联合组14 d大鼠脑组织含水量较脑脉通组和动员组均明显降低(P＜0.01)。各实验组大鼠7 d脑含水量分别较其2 d和3 d组增加(P＜0.01)、14 d组较7 d组的降低显著(P＜0.01)，见表4。表4 各组大鼠脑组织含水量和脑梗死面积变化比较(略)

　　2.7 大鼠脑梗死面积变化

　　各模型组大鼠脑梗死面积均较假手术组显著增大(P<0.01)；与模型组比较，脑脉通组和联合组各时间点的脑梗死面积减小，动员7 d和14 d组减小明显(P<0.05，P<0.01)。动员组和脑脉通组比较无显著统计学差异(P>0.05)。联合组7 d和14 d大鼠闹梗死面积较脑脉通组和动员组减小(P<0.05，P<0.01)。模型组和脑脉通组7 d的脑梗死面积分别较其2 d和3 d组增大(P<0.01)，联合组14 d较其2 d和3 d组减小(P<0.01)；模型组、动员组和联合组14 d的脑梗死面积分别较其7 d减小(P<0.05，P<0.01)，见表4。

　　2.8 大鼠脑组织病理观察

　　HE染色光镜观察，各模型组大鼠神经细胞周围明显水肿，部分神经元胞体缩小，核固缩、深染，神经纤维水肿明显，走形紊乱，以缺血后3 d和7 d的改变明显，14 d神经细胞水肿减轻，发生变性、坏死的神经元减少，损伤呈先加重再减轻趋势；动员组大鼠2 d的神经细胞损伤与模型组无明显差异，7 d和14 d的神经细胞受损均较模型组减轻；脑脉通组和联合组各时间点大鼠的损伤较模型组减轻，联合组7 d和14 d的病理损伤减轻明显。

　　3 讨论
　　
　　BMSCs动员是新兴的细胞移植方法，在脑缺血损伤的保护与修复方面愈来愈受到关注，有望成为治疗脑梗死新的有效途径〔8，9〕。GCSF是BMSCs强力的动员剂，可显著提高外周血BMSCs数量并使其向脑缺血区的归巢增加，通过观察脑缺血后CD34+细胞数量或表达变化，可反映骨髓干细胞进入外周血及向脑组织归巢的特点以及保护脑缺血损伤的作用〔10〕。脑脉通由大黄、人参、川芎、葛根组成，具有解毒降浊、益气活血功效，对脑缺血损伤具有明显的保护作用，且可使BMSCs移植后抗脑缺血损伤的作用增强〔4，11〕。本研究显示，脑缺血可引起BMSCs自发进入外周血及向脑组织归巢，其在外周血的变化呈先增多再减少的特点，3 d达到峰值；缺血后2 d脑组织可检测到CD34+细胞表达，这与已有的报道一致〔12〕，其7 d达到峰值的时间较外周血延后，表明BMSCs从骨髓进入外周血，再由外周血进入脑组织的分布特点存在时间上的续惯性，脑脉通的应用未能影响这一特点，但使经动员的外周血和脑组织骨髓干细胞数量增多，且使脑组织峰值时间延长。另外，组织学观察发现，骨髓干细胞动员可减轻脑缺血引起的病理损伤和改善神经功能缺损、减轻脑水肿、减小梗死面积，应用脑脉通使其脑保护作用明显增强。本研究可为中药在骨髓干细胞动员抗脑血损伤方面的进一步探索的和临床应用提供依据，其确切作用机制有待进一步探讨。

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