作者：李晓涛 路来金 李艳君 解云川
【摘要】 目的 观察银杏叶提取物（EGB）对大鼠海马神经干细胞（NSCs）增殖及分化为神经元样细胞的影响。方法 取新生24 h内的Wistar大鼠海马组织细胞进行体外培养，1 w后将其接种在培养板中，在不同时间点观察不同浓度EGB 对细胞生长的作用，并检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。结果 各实验组NSCs生长明显好于对照组，免疫细胞化学显示：在同一时间内，不同浓度EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分率随着EGB浓度升高呈上升趋势；随着细胞培养时间的延长，相同浓度EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分率有下降趋势。结论 EGB能促进NSCs的存活、增殖并在一定时期内可促进NSCs向神经元样细胞的方向分化。
【关键词】 神经干细胞；银杏叶提取物；神经元样细胞；分化
传统观点认为，哺乳动物中枢神经系统的神经元细胞只存在于胚胎期及出生后不久的一段时间，随后神经元分裂即告结束。1992 年，Reynolds 等〔1〕从成年小鼠纹状体分离出能在体外不断分裂、增殖、具有多分化潜能的细胞群，于是提出“神经干细胞（NSCs）”的概念。银杏叶提取物（EGB）对中枢神经系统（CNS）可塑性的影响不仅表现为其对前庭代偿和新生大鼠视通路可塑性的影响，还表现为其对CNS 海马区突触可塑性的影响。最近发现，EGB 及其成分BN52021可能影响海马、齿状回等处长时程突触增强（LTP）的诱导和形成。本实验通过观察EGB对大鼠海马NSCs增殖及分化为神经元样细胞的影响，探讨EGB作用于NSCs的可能机制。
1 材料与方法
1.1 NSCs的获取与培养
①取出生24 h以内的Wistar 大鼠，由佳木斯大学实验动物中心提供。在无菌条件下分离出脑组织的海马；②将海马组织用Hank平衡盐溶液漂洗3次；③移至预先加入适量DMEM/F12培养液的小瓶中，将组织块剪碎，用吸管吹打成细胞悬液；④经台盼蓝计数后以5×105个/ml 密度接种于25 cm2培养瓶中，同时加入适量含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 20 ng/ml、表皮生长因子(EGF) 20 ng/ml、2%B27的DMEM/F12培养液，置于培养箱中培养。⑤培养条件：37℃、5% CO2、80%湿度，每3 d换1/2液体，第7天开始传代。
1.2 EGB诱导NSCs的分化及鉴定
①将上述培养形成的NSCs团，离心，弃上清液，然后在离心管重新加入培养液，再用吸管吹打成单细胞悬液后，接种至3块24孔培养板中，培养板的各孔中均预先放置一块经多聚赖氨酸(50 μg/ml) 涂布的盖玻片。②将24孔培养板分为4 组：对照组（培养液为含2%B27的DMEM/F12）、EGB 10、20、40 μg/ml组（2% B27的DMEM/F12分别加入不同浓度EGB），平均每组6 孔，将培养板置于培养箱中。于培养时间7、14、21 d分别对盖玻片上贴壁细胞进行ABC免疫酶标技术DAB显色。在10×25相差显微镜下，随机选取4个视野，计数阳性细胞数、细胞总数和阳性细胞百分数。
1.3 统计学分析
数据用x±s表示，采用SAS统计学软件进行方差分析和q检验。
2 结 果
贴壁培养的细胞中，细胞团在贴壁2 h后就可观察到细胞团中细胞向外伸出突起。NSCs贴壁分化后，神经元样细胞的胞体形态呈圆形或椭圆形，有一个或两个尖细突起，突起上的分支较多。在一块培养板上，同一时间点，不同浓度的EGB组，诱导NSCs分化为神经元样细胞（NSE阳性）的百分比都高于对照组(P<0.05，P<0.01)，并随药物浓度的递增有升高的趋势；然而同一浓度的EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分比却随着培养时间的延长有下降的趋势。见表1。表1 各组培养物贴壁培养不同时间点NSE阳性细胞百分率(略)
3 讨 论
本实验采用含2%B27的DMEM/ F12作为基础培养基，并向其中加入EGF和bFGF这两种细胞有丝分裂中重要的生长因子，其主要作用是促进细胞有丝分裂，抑制细胞分化。如果培养基中不加入生长因子或者生长因子浓度过低，细胞悬浮生长一段时间，然后逐渐衰老死亡。EGF和bFGF在哺乳动物胚胎时期神经系统发育的各个阶段，都能促进细胞分裂、增殖，并且bFGF能促进EGF反应性细胞表达，二者产生协同效应。EGF和bFGF对NSCs的作用还与其浓度有关。有实验证实：二者均在20 ng/ml左右时，其促进细胞分裂的效应最强。因此本实验中，在细胞的原代培养时，在培养基中加入EGF和bFGF，浓度均为20 ng/ml。结果7 d时观察到培养基中形成大量的NSCs球，这与先前报道的结果一致〔2〕。7 d后，当细胞增殖达到一定数量，在24孔培养板中贴壁培养时，在培养孔中加入不含EGF和bFGF的基础培养液，此时细胞虽然在数量上有所减少，生存周期有所缩短，但这样能排除EGF和bFGF对NSCs分化的干扰，能比较客观地反映EGB对NSCs分化的影响。
NSCs定向分化与其所处的微环境关系密切〔3〕。本实验利用ABC免疫酶标DAB显色法鉴定NSCs的定向分化，结果表明EGB能够促进NSCs分化。但促进NSCs向神经元样细胞分化的最佳浓度要在以后的实验中探索。不同的时间内，相同浓度EGB促NSCs分化的结果比较发现：EGB诱导NSCs分化为神经元样细胞的百分率，随时间延长，有下降趋势。这提示神经细胞在发育的过程中，对微环境中营养因子、促分化因子的需求不同，或者与神经元分化的内在因素有关。
EGB促进NSCs增殖及分化的可能机制包括：①EGB对神经细胞凋亡的抑制作用：EGB具有增强神经细胞活性，保护神经细胞染色体，使其免于断裂，而发挥抗细胞凋亡的作用，由此将延长细胞的存活时间。②EGB通过对血小板活化因子（PAF）的拮抗作用：抑制兴奋性氨基酸的释放，防止细胞内钙离子的异常增高及蛋白酶C被激活，进而降低cfoc及cfun表达，避免细胞受到损害。③EGB发挥抗氧化的作用：通过改变NSCs内氧化还原状态，加强线粒体氧化磷酸化能力，促进NSCs能量代谢，使其分化为NSE阳性细胞。④直接进入NSCs内或者与NSCs膜上的受体结合，然后激活Ngn1、Ngn2、Mash1等转录调控因子〔4〕，进而促使NSCs向神经元样细胞方向分化。
参考文献
1 Reynolds BA，Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system〔J〕.Science，1992；255:1707.
2 尹国才，陈新生，郑爱芳，等.人胎脑神经干细胞在发育期脑脊液中的迁移和分化〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2010；14(1)：247.
3 Lu LJ，Chen L，Meng XT，et al.Biological effect of velvet antler polypeptides on neural stem cells from embryonic rat brain〔J〕. Chin Med J， 2005;118(1)：3842.
4 Lin M，Yang L，Fu R，et al.Cloning of the eukaryotic expression vector with nerve growth factor in rats and its effects on proliferation and differentiation of mesencephal neural stem cells of fetal rats〔J〕. J Huazhong Univ Sci Technol(Med Sci)，2008；28(5)：5136.