银杏叶提取物对脂质诱导胰岛素抵抗大鼠脂肪肝的干预作用

　　　　作者：夏瑾玮 黄高忠 张秀珍 叶希韵 陈雅娟 钟远

【摘要】 目的 探讨胰岛素抵抗（IR）与糖脂代谢、脂肪肝之间的相互关系，为银杏叶制剂用于早期预防脂肪肝和进一步治疗提供实验依据。方法 选取健康成年SD雄性大鼠40只，体重200～250 g，适应性饲养1 w后将大鼠编号，随机大鼠分入正常组、模型组、银杏叶组、阳性药物组;每周监测大鼠的血糖和体重，干预12 w后处死动物，收集血液进行血液生化指标检测（FBG、2 hPG、FINS、PINS、血脂、肝脂及肝酶）;并计算胰岛素敏感指数(ISI)值，评估造模是否成功;然后进行肝脏的形态学观察;最后进行有关的统计学分析。结果 ①与正常组比较，模型组ISI值下降，血糖、血脂水平升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较，银杏叶组、阳性药物组的ISI值升高，血糖血脂水平下降，统计学有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；②与正常组相比，模型组大鼠的体重、肝体比及肝组织TG、FFA、ALT、AST均显著升高;治疗后肝组织TG、FFA明显降低，但仍高于正常组（P<0.05）；③模型组肝组织MDA活性显著升高，总抗氧化能力(TAOC)及SOD活性显著降低(P<0.01)，与模型组比较，各治疗组大鼠肝组织SOD活性及TAOC升高、MDA活性降低(P<0.01)，TAOC和MDA呈负相关(r=-0.312，P<0.01)；④模型组大鼠肝细胞均呈现弥漫性脂肪变性、肝小叶内炎症及线粒体异常，治疗后肝细胞均较模型组肝细胞明显缩小，胞质内可见细小的脂滴，而正常组大鼠的肝脏无异常的形态学变化。结论 ①IR大鼠普遍存在脂肪肝，体重、FPG、TG、和FFA是发生IR独立的危险因素;IR可能在脂肪肝形成过程中起了重要作用，且脂肪肝参与了代谢综合征的发生和发展；②银杏叶提取物能够明显改善IR大鼠的糖脂代谢，有效降低游离脂肪酸水平，从而起到防治脂肪肝的积极作用；③银杏叶提取物能够明显改善模型组大鼠的IR，提高胰岛素的敏感性;同时，可以部分或显著逆转IR所致的脂肪肝的程度，降低肝脂、肝酶。

【关键词】 胰岛素抵抗，大鼠；脂肪肝；高脂血症；银杏叶提取物

　研究表明，胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)、代谢综合征(MS)、动脉粥样硬化(AS)的共同发病基础，IR在脂肪肝的发生中亦起着极其重要的作用〔1，2〕。非酒精性脂肪肝（NAFLD）亦属一种慢性进展的非特异性炎症，近来发现，脂肪细胞也是重要的炎症细胞，炎症因子干扰了胰岛素受体后的信号传导通路，导致IR的发生〔3〕。探索IR与脂肪肝的关系对早期防治NAFLD显得尤为重要。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料
　
　　1.1.1 动物

　　选取健康成年SD雄性大鼠40只，体重200～250 g，购自上海第二军医大学动物实验中心；在恒温22℃、相对湿度50%～60%、光照周期12 h环境中适应性喂养1 w。

　　1.1.2 药物

　　基础饲料购自上海第二军医大学动物实验中心，高脂饲料由华师大生物实验室自行配制，配方：脂肪热比为59%（其中猪油占39%），蛋白质热比为21%（其中酪蛋白占31%），碳水化合物热比为20%（其中玉米淀粉占30%），此外附加必需的维生素和矿物质；罗格列酮，4 mg/片，葛兰素史克公司提供；银杏叶提取物(银杏总黄酮≥44%）为上海杏灵科技药业股份有限公司研发的一种新型银杏叶提取物制剂。

　　1.1.3 试剂

　　南京建成生物制品研究所提供总抗氧化能力（TAOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、游离脂肪酸（FFA）、谷丙转氨酶（ALT/GPT）、谷草转氨酶（AST/GOT）、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒；美国Linco公司提供Ins试剂盒；甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、血清高密度脂蛋白（HDLC）测试盒购于温州津玛生物科技有限公司；葡萄糖酶法测定试剂盒、血清低密度脂蛋白（LDLC）测试盒，购于上海科欣生物技术研究所；胰岛素放射免疫分析测试盒购于北京北方生物技术研究所。

　　1.1.4 仪器设备

　　日立7600型全自动生化分析仪；国产全自动放射免疫γ计算仪；芬兰LABSYSTEMS MULTISKAN MS(353型)酶标仪；上海产802型低速离心机；日产岛津UV2100分光光度仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 造模与分组

　　适应性饲养1 w后将SD大鼠编号，按照随机数字表将大鼠分入正常组、模型组、银杏叶组、阳性药物组，每组10只。正常组予以基础饲料喂养，模型组予以高脂饲料喂养，银杏叶组予以高脂饲料+银杏叶提取物，阳性药物组予以高脂饲料+罗格列酮，每笼均为5只，自由进水进食，12 h光照周期，室温18℃～25℃，相对湿度50%～60%，除正常组外，其余各组均喂食高糖高脂饲料(常规饲料67.8%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2%、胆酸钠盐0.2%)。连续8 w后，测定空腹血糖(FPG)或/和糖负荷后2 h血糖(2 h PG)，采用稳态模式IR指数(HOMAIR)评价IR，造模大鼠80%达标。

　　1.2.2 给药方法

　　正常组、模型组大鼠分别灌服等体积生理盐水，银杏叶组予以银杏叶总黄酮，用量为0.1 g·kg-1·d-1灌胃；阳性药物组灌服罗格列酮3 mg·kg-1·d-1，压碎，1次/d，连续8 w。

　　1.2.3 标本收集

　　饲养12 w后，自由饮水，禁食12 h后，颈静脉取血离心后取血清测有关指标。打开腹腔充分暴露肝脏，取出整个肝脏称取肝脏湿重，从肝右叶中部取小块肝组织以备形态学观察，制成石蜡切片进行苏木素尹红(HE)染色及免疫组化染色，剩余肝组织制成10％肝脏匀浆置于-78℃超低温冰箱内以备测肝脂及肝酶的含量。

　　1.2.4 测定指标及方法

　　采用葡萄糖氧化酶法测定FPG，用酶法测定血清TG、TC、HDLC、LDLC，放免试剂盒测定血清胰岛素含量；用分光光度仪比色法测定血清FFA，MDA测定采用硫代巴比妥酸法，TAOC测定采用Fe3+/Fe2+还原法，用酶法测定肝脂（TG、TC、LDLC、HDLC、FFA）及肝酶（ALT、AST、MDA、SOD、LDH）的含量。计算胰岛素敏感指数（ISI）=In(1/FPG×FINS)，因其为非正态分布，取其自然对数进行统计分析，计算HOMAIR=FPG×FINS/22.5 Lee′s 指数是反映大鼠肥胖程度的指标，有评价成年大鼠肥胖程度方面的可行性与准确性。计算Lee′s指数=3体重×103/体长(cm)〔4〕。

　　1.2.5 内脏形态学观察

　　取大鼠肝组织，称湿重后用10％甲醛液固定，切片、HE染色，光镜下观察组织学改变，并用计算机彩色图像分析肝脏脂肪变性程度；测定大鼠肝脏湿重，并计算肝体比(肝脏湿重/体重×100%)。

　　1.3 统计学分析

　　所有数据以x±s或百分比表示，对计量资料进行正态性、方差齐性检验，非正态及方差不齐者，进行自然对数转换。两组间比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析；多因素分析采用Logisitic回归分析；组间率的比较用χ2检验。采用SAS6.12统计软件进行处理。

　　2 结 果

　　2.1 一般状况

　　正常组大鼠体重增加明显，精神状态良好，反应灵敏，皮毛有光泽，动作自如。模型组大鼠明显肥胖，多饮、多尿、多食，精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，动作迟缓，弓背蜷体。各治疗组与模型组相比，精神状态尚可，动作尚自然灵活，体重增加，饮水量减少，尿量减少，其中阳性药物组大鼠一般状态较模型组好，银杏叶组大鼠表现较阳性药物组状态好。提示银杏叶制剂治疗后，可以使IR大鼠的多饮、多尿和肥胖等症状得以明显的减轻。

　　2.2 各组大鼠肝脏重量及其肝体比的比较

　　实验12 w时发现，模型组大鼠存在肝脏肿大，体重与肝体比明显高于正常组(P<0.01);治疗组与模型组相比，体重与肝体比有明显下降。见表1。表1 各组大鼠肝重及其肝体比比较(略)

　　2.3 各组大鼠的血糖与IR的比较

　　实验末测得正常组大鼠FPG为(6.09±0.51)mmol/L，根据FPB＞7.0 mmol/L伴IR为造模成功的标准，本实验造模动物80%达到要求;12 w末测定了空腹胰岛素和胰岛素敏感性，结果显示模型组与正常组比较，FPG及胰岛素明显升高，而HOMAIR明显升高，有显著差异。经治疗后，血糖及IR均有明显好转，阳性药物组疗效更佳;同时，测定结果显示正常组大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)值为(1.61±0.08)％，模型组中全部动物HbA1c〔(3.41±0.75)％〕超过了正常大鼠的平均值。见表2。表2 各组大鼠血糖及IR、敏感指数的比较(略)

　　2.4 各组大鼠的血脂代谢比较

　　模型组大鼠体型短而粗壮，其Lee′s指数明显增加，与其他各组比较均有统计学差异(P<0.01)。相关分析结果表明:各组大鼠Lee′s指数的变化与相应的体重增加、腹腔脂肪湿重及血TC、TG、LDLC呈高度正相关，r值分别为0.804 4、0.858 3、0.729 0、0.761 2、0.704 8，均P<0.01，而与HDLC呈高度负相关(r=0.750 4，P<0.01)。模型组大鼠血浆动脉硬化指数(atherogenic index of plasma，AIP)，明显高于正常组(P＜0.01)。经治疗后，血脂代谢及AIP指数有明显改善，阳性药物组疗效优于银杏叶组。见表3～表5。表3 各组大鼠Lee′s指数及其腹腔脂肪湿重比较(略)表4 各组大鼠血脂含量及AIP比较(略)表5 各组大鼠肝生物化学指标变化(略)

　　2.5 各组大鼠肝生化指标的比较

　　与正常组相比，模型组大鼠的肝组织TG、FFA、ALT、AST均显著升高；治疗组的肝组织TG、FFA明显降低，但仍高于正常组，两组治疗效果相比无显著差异(P>0.05)。与正常组比较，模型组肝组织MDA活性显著升高、TAOC及SOD活性显著降低(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组均可使IR大鼠肝组织SOD活性及TAOC升高、MDA活性降低(P<0.01)。治疗后，TAOC/MDA逐渐增加，提示机体的综合氧化应激状态逐渐改善。TAOC和MOA的相关性分析显示两者呈负相关(r=-0.312，P<0.01)。见表5。

　　2.6 胰岛素抵抗的危险因素 Logistic 回归分析

　　以正常组与模型组为研究对象，HOMAIR为应变量，体重、FPG、FFA、FINS、2 hINS、TC、TG、LDLC、NO、ET1和AngⅡ为自变量，Logistic 回归分析(ForwardWald 法)显示，体重、TG、FFA和FPG是SD大鼠发生IR独立的危险因素(B分别为0.523、0.135、0.264 和0.039，SE分别为0.184、0.027、0.089 和0.015，OR分别为0.263、0.416、0.220和0.194，P值分别为0.006、0.000、0.004和0.009)。回归方程=体重×0.523 + TG×0.135 + FFA×0.264 + FPG×0.039-1.808。

　　2.7 大鼠肝组织的形态学改变

　　正常组:肝细胞排列整齐，肝小叶规则，细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀。模型组:大鼠肝细胞肿胀、体积较正常明显增大，细胞内可见大小不等的脂滴空泡，严重者胞质疏松呈渔网状改变，且存在小叶内及汇管区炎细胞浸润。治疗组:肝细胞均较模型组肝细胞明显缩小，胞质内可见细小的脂滴。免疫组化结果:正常组肝组织内仅有少量棕黄色颗粒;模型组肝组织内棕黄色颗粒明显增多，以肝窦周围及汇管区明显;治疗组肝组织内棕黄色颗粒较模型组明显减少且表达强度降低。见图1。

　　3 讨 论

　　IR泛指胰岛素在周围组织中对葡萄糖的摄取和清除作用降低的一种病理生理状态，发生机制包括受体前、受体和受体后水平〔5，6〕，与遗传和环境因素密切相关。文献报道，用高脂饮食（HF）饲养正常大鼠4～8 w后，即可引起周围组织（肝脏、骨骼肌等）广泛的IR，HFIR动物模型已广泛应用于IR相关各种机制及干预手段的研究，其中尤以鼠类模型最为多见〔7，8〕。

　　自1980年提出NAFLD后，相当长的一段时间研究重点集中在肝脏病变本身，即单纯肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎以及最终发展为肝硬化的演变。肝脏作为重要的糖代谢调节器官，对它在糖尿病糖脂代谢异常中病理生理机制的研究具有重要意义，大量研究显示NAFLD患者具有肥胖、脂代谢紊乱、高血压和糖代谢异常等IR的特征，目前认为，NAFLD是遗传、环境、代谢等因素所致，以肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。国外报道〔9〕，在NAFLD人群中MS的比例高达36%，伴不同程度糖代谢异常者约占50%。目前NAFLD的发病机制仍未阐明，多数学者认为发生NAFLD的基础是IR〔10〕。

　　本研究发现，体重、FPG、TG、和FFA是发生IR独立的危险因素；这与近年来的研究报道相似，IR可能在脂肪肝形成过程中起了重要作用，且脂肪肝参与了MS的发生和发展。结果还显示，肝酶升高与MS的多个组分呈正相关。IR是现在已知的在NAFLD发病中最重要的一个环节。外周IR可能使抑制激素敏感性脂肪酶的活性下降，外周脂肪组织分解增加，FFA水平升高，而FFA水平升高可加剧患者的IR〔11〕。脂肪肝大鼠有明显超重及腹内脂肪堆积的现象。

　　目前的脂肪外溢假说是指脂肪过量和脂肪组织功能障碍引起FFA和TG外溢，沉积在非脂肪组织，从而造成沉积组织的功能障碍，如骨骼肌IR、β细胞功能受损、脂肪肝。IR导致脂肪外溢沉积于肝脏的可能机制包括：①IR引起脂肪组织脂肪分解；②外源性脂质摄入过多超过脂肪组织的处理能力；③脂肪细胞萎缩引起脂肪细胞储脂能力下降。但对脂肪组织储脂能力下降造成脂肪外溢的确切机制尚未阐明。

　　“两次打击”〔12〕学说提出:首先，HOMAIR升高导致脂质在肝细胞的蓄积；第二次打击的出现以线粒体为中心，可能包括一条或多条途径促进氧化应激，导致脂质过氧化，诱导细胞因子及Fas配体合成，线粒体合成ATP功能衰竭等，最终加速肝细胞损伤，甚至导致肝细胞死亡，激发非酒精性脂肪肝炎(NASH)及肝纤维化。已知脂肪酸代谢通路与线粒体和过氧化物酶β氧化密切相关，其β氧化相关酶的缺陷可影响脂肪酸代谢，导致肝脂肪变性和脂肪性肝炎〔13〕。NAFLD发病率呈逐年上升趋势，其病因及发病机制均相当复杂，至今尚未完全阐明，可能与肝细胞中脂肪的长期集聚和肝脏氧化应激作用增强有关，后者的直接原因即为IR。

　　本研究显示发生NAFLD的大鼠HOMAIR高于对照组，提示NAFLD存在IR，多因素分析显示IR是NAFLD的独立危险因素，在IR状态下，胰岛素对脂肪代谢的调节作用减弱，使血液中FFA的摄取和TG合成增多，肝细胞内脂肪沉积，肝细胞变性、肿大形成脂肪肝，这可能是脂肪肝发生的原因之一。

　　由于对NAFLD缺乏可靠的特异性治疗方法，目前多采用综合治疗策略，主要包括:改善IR(采用生活方式干预治疗、减轻体重和应用胰岛素增敏剂，如二甲双胍、噻唑烷二酮类药物)；调脂降糖治疗；抗氧化治疗和肝细胞膜保护剂治疗等。策略中进行生活方式干预减轻体重是最主要的病因治疗，适度减轻体重可首先降低肝内脂肪含量，改善肝脏IR，从而改善血糖控制，而且这一作用发生于骨骼肌细胞内脂肪含量减低之前，即减轻体重使肝脏IR改善先于外周IR的改善，因此生活方式干预减轻体重对NAFLD是最重要的治疗措施。

　　有研究发现罗格列酮可以显著降低血清TG、ALT及肝组织TG的水平，减少了脂质在肝脏的聚积，减轻了肝脏的炎性反应〔14〕，本研究结果与此研究结果一致。说明罗格列酮在改善IR相关因素的同时改善脂质代谢紊乱，减轻了肝脏的脂肪变性及炎症。

　　氧化应激（OS）是指体内活性氧化物质的产生与抗氧化防御体系之间失衡，从而导致组织损伤的一种状态。MDA含量和SOD活性的变化可间接评定组织氧化损伤程度。TAOC测定可以清楚地显示糖尿病患者抗氧化防御降低，并且总的抗氧化能力比单个的抗氧化测定能更好地反映抗氧化剂状态。本研究中模型组大鼠肝组织的OS产物MDA水平明显升高，表明肝脏组织中存在着明显的OS，且TAOC和MDA呈负相关，说明随着体内脂质自由基损伤终产物的浓度增加，体内抗氧化物质消耗增加，体内总的抗氧化能力下降，机体的OS增强。

　　许多研究发现糖尿病患者血的抗氧化指标水平下降，OS标志物水平升高，证实高血糖可以诱导OS〔15〕。体内对抗自由基的物质能保护细胞中某些过氧化酶免受活性氧的灭活，加强机体抗氧化酶系统的功能，有助于消除自由基及活性氧对细胞膜的损伤。在本研究中，银杏叶可使IR大鼠肝组织SOD活性及TAOC升高，降低MDA含量，且有一定量效关系，说明该药物具有清除大鼠心肌自由基、增强抗氧化能力的作用，可以调节和改善自由基代谢平衡，从而调节体内的OS异常机制。

　　银杏主要成分为银杏黄酮，药理研究报道具有清除氧自由基和抑制脂质过氧化的作用〔16〕。对血管紧张素转换酶具有明显抑制作用，促进NO的释放，具有较强的扩血管作用，本研究进一步证实：银杏叶可显著提高早期糖尿病大鼠组织SOD活性，降低MDA含量，表明银杏叶提取物早期应用可以延缓糖尿病脂肪肝的发生，还能够明显改善模型组大鼠的IR，提高胰岛素的敏感性，部分或显著逆转IR所致的脂肪肝的程度，降低肝脂、肝酶，对IR可能存在一定的干预机制。

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