急性心肌缺血大鼠心肌中AT1/AT2的表达变化

　　　　 作者：刘世丽 康劲松 王伟伟 钟加藤 曲仙智 于慧美 张勇 刘宁 李洪岩

【摘要】 目的 探讨急性心肌缺血大鼠心肌组织中肾素-血管紧张素系统（RAS）的表达变化。方法 通过结扎大鼠冠状动脉左前降支复制急性心肌缺血模型。采用RTPCR方法测定心肌组织中血管紧张素原（AGT）、血管紧张素转换酶（ACE）、血管紧张素1型受体(AT1)/血管紧张素2型受体(AT2)及水通道蛋白4（AQP4）mRNA的表达。结果 与假手术组相比，急性心肌缺血组大鼠心肌组织中AGT mRNA的变化不明显，ACE及AT1 mRNA的表达明显降低(P＜0.05)，AT2 及AQP4 mRNA的表达明显升高(P＜0.05)。结论 局部RAS及AQP4参与了急性心肌缺血的过程。

【关键词】 肾素血管紧张素系统；心肌缺血；血管紧张素1型受体；血管紧张素2型受体；水通道蛋白4

研究表明，大多数肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)的组分可以在心肌、脑、肾脏、血管等组织中生成，而局部RAS可以通过自分泌、旁分泌和胞内分泌方式独立影响器官功能，并在某些心血管疾病如缺血性心肌病、高血压、心肌肥厚、充血性心衰等发生发展中起重要作用〔1〕，但其具体机制不十分清楚。本研究通过结扎大鼠冠状动脉前降支复制急性心肌缺血模型，采用RTPCR法测定心肌组织RAS系统中血管紧张素原（AGT）、血管紧张素转换酶（ACE）、血管紧张素1型受体(AT1)、血管紧张素2型受体(AT2)及水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）的mRNA表达，进一步探讨局部RAS系统在大鼠急性心肌缺血过程中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　琼脂糖（北京鼎国生物技术有限公司），焦磷酸乙二酯（DEPC）、溴化乙锭（EB）（美国Sigma），Trizol（美国Invitrogen公司），AMV逆转录酶、Oligo dT、dNTPs、TaqDNA聚合酶和DL2000 DNA Marker（日本Takara公司）。

　　1.2 实验动物及分组

　　健康Wistar大鼠，雌雄不限，体重250～300 g，由吉林大学实验动物中心提供。随机分为假手术组、缺血模型组，每组10只。

　　1.3 大鼠急性心肌缺血模型的复制

　　水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉大鼠并固定在手术板上。常规消毒左侧胸部，剪开皮肤，按肌肉层次分离暴露胸壁。在左侧4、5肋间暴露心脏。以肺动脉圆锥及左心耳交界处的左冠状动脉主干为标志，用6/0无损伤缝合线穿过做心耳下缘的心肌浅层，结扎冠状动脉左前降支(假手术组只穿线不结扎)。丝线逐层缝合肌肉、皮肤。

　　1.4 RTPCR检测心肌组织中AGT、ACE、AT1、AT2及AQP4 mRNA的表达
　　参照Trizol试剂盒的方法提取心肌组织总RNA。采用逆转录酶和Oligo dT18引物将总RNA反转录为cDNA，进行PCR反应。AGT上游引物：5′TTGTTGAGAGCTTGGGTCCCTTCAC3′，下游引物：5′CACAGACACTGAGGTGCTGTTGTCCA3′，待扩增产物长度为265 bp，退火温度为58℃；ACE上游引物：5′GCAGAACTTCACTGACCAAAAG3′，下游引物：5′TCAAAGGAGGGGGACTCATA3′，待扩增产物长度为383 bp，退火温度为55℃；AT1上游引物：5′GCACAATCGCCATAATTATCC3′，下游引物：5′CACCTATGTAAGATCGCTTC3′，待扩增产物长度为445 bp，退火温度为53℃；AT2上游引物：5′GTGTCCAGCATTTACATCTTCA3′，下游引物：5′CACCAAACAAGGGGAACTAC3′，待扩增产物长度为275 bp，退火温度为53℃；AQP4上游引物：5′TTGGACCAATCATAGGCGC3′，下游引物：5′GGTCAATGTCGATCACATGC3′，待扩增产物长度为214 bp，退火温度为57℃；GAPDH作为内对照，上游引物：5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，下游引物：5′AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAG TC3′，待扩增产物长度为617 bp，退火温度为58℃。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为94℃变性45 s，退火45 s（扩增产物不同，退火温度不同），72℃延伸45 s，30个循环。 取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用上海天能科技有限公司GIS凝胶成像系统照相，特异性条带的丰度值用GIS图像分析系统处理。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据采用x±s表示，其中电泳条带密度值以灰度×面积/参照物的值表示。采用SPSS11.0统计软件包处理，组间比较用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 急性心肌缺血大鼠心肌中AGT、ACE、AT1及AT2 mRNA的表达

　　RTPCR结果显示：假手术组大鼠心肌中AGT及AT2 mRNA呈弱表达；与假手术组相比，急性心肌缺血组的AGT mRNA表达改变不明显，亦呈弱表达；而急性心肌缺血组的ACE、AT1 mRNA表达明显降低(P＜0.05)，AT2 mRNA表达明显升高(P＜0.05)（见图1）。

　　3 讨 论

　　本实验证明正常大鼠的心肌细胞中均有AGT、ACE、AT1、AT2 mRNA的表达。这与Anversa等〔2〕报道的成年大鼠心室肌细胞含有产生血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的各种成分结果相一致。正常情况下，AGT在心脏组织中的表达量很少，其在肾素的作用下生成AngⅠ，AngⅠ再经ACE的作用生成AngⅡ，AngⅡ的生物学效应主要通过AT1介导，包括收缩血管、升高血压、促进细胞增殖等。本研究发现假手术组大鼠心肌的AGT mRNA呈弱表达，急性心肌缺血组大鼠心肌的AGT mRNA没有明显变化，提示大鼠心脏组织的AGT对急性缺血反应不灵敏。本研究显示，急性心肌缺血组大鼠心肌组织的ACE mRNA表达明显降低，结合AGT mRNA表达没有明显改变的结果，推测急性心肌缺血可能不影响局部AngⅡ的产生。

　　AngⅡ的作用是通过特异性受体AT1和AT2介导的。AT1受体主要分布在人体的血管、心脏、肾脏、脑、肺和肾上腺皮质，介导大部分AngⅡ的生物学效应。AT2受体在胚胎组织的主动脉和小阻力动脉中高表达；在成年人的某些特定组织上呈低表达，如脑、肾、肾上腺髓质以及生殖组织中；而在心衰、心肌损伤、心血管损伤和脑损伤等一些病理条件下，AT2受体表达水平则明显增高〔3，4〕。目前研究表明，AT2与胚胎发育、细胞分化、凋亡等生物过程有关，且在某些方面具有与AT1拮抗的作用，如AT2可以引起血管舒张，这与AT1引起的血管收缩效应相反〔5〕。本研究可见急性心肌缺血组大鼠心肌组织AT1 mRNA表达降低，与李占清等〔6〕报道结果相一致，但亦有相反的结果报道〔7〕，这是由于AT1的表达是由细胞内不断新合成AT1 mRNA与原有AT1 mRNA降低的不断平衡所致。而本研究中急性心肌缺血组大鼠心肌组织AT2 mRNA表达与AT1 mRNA的变化呈相反趋势，表现为明显升高，与文献报道一致〔8〕。

　　AQPs分布于水分代谢活跃的器官中，在介导自由水被动跨生物膜转运、维持细胞内外环境的稳定平衡中具有特殊作用，AQP4 为其中的一个亚型。在心肌组织中水的跨细胞转运经过3个途径：（1）经脂质双分子层的弥散；（2）与离子及底物转运通道相偶联；（3）经AQPs蛋白转运〔9〕。研究表明在这种方式水转运中，经细胞裂隙的水转运占2/3，而经AQP蛋白为1/3〔10〕。因此AQPs蛋白在心肌的水肿形成和发展中占有重要地位。本研究结果可见，在大鼠急性心肌缺血的心肌组织中AQP4 mRNA表达增强，说明AQP4参与了缺血后的水肿形成。

参考文献

　1 Lee MA，Bhm M，Paul M，et al.Tissue reninangiotensin systems.Their role in cardiovascular disease〔J〕.Circulation，1993;87(5 Suppl):IV713.

　　2 Anversa P，Leri A，Li B，et al.Ischemic cardiomyopathy and the cellular reninangiotensin system〔J〕.J Heart Lung Transplant，2000;19(8 Suppl):S111.

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　　4 Schulman IH，Raij L.The angiotensin Ⅱ type 2 receptor:what is its clinical significance〔J〕? Curr Hypertens Rep，2008;10(3):18893.

　　5 周 娟，刘进军，高广道.压力超负荷性肥大心肌细胞AT1和AT2 mRNA表达的动态变化〔J〕.第四军医大学学报，2007;28(11):10024.

　　6 李占清，路万里，陈 晨，等.左心辅助对急性左心衰犬心肌局部Ang Ⅱ受体mRNA表达的实验研究〔J〕.中华胸心血管外科杂志，2005;21(1)：357.

　　7 Leri A，Liu Y，Li B，et al.Upregulation of AT(1) and AT(2) receptors in postinfarcted hypertrophied myocytes and stretchmediated apoptotic cell death〔J〕.Am J Pathol，2000;156(5)：166372.

　　8 Zhu YZ，Zhu YC，Li J，et al.Effects of losartan on haemodynamic parameters and angiotensin receptor mRNA levels in rat heart after myocardial infarction〔J〕.J Renin Angiotensin Aldosterone Syst.2000;1(3)：25762.

　　9 Wright AR，Rees SA.Cardiac cell volume：crystal clear or murky waters? A comparison with other cell types〔J〕.Pharmacol Ther，1998;80(1)：89121.

　　10 Kellen MR，Bassingthwaighte JB.Transient transcapillary exchange of water driven by osmotic forces in the heart〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003;285(3)：H131731.