核转录因子κB抑制因子对中性粒细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨脂多糖(LPS)刺激下核转录因子κB（NFκB）抑制因子（IκBα）对中性粒细胞凋亡的影响。方法 离体培养人中性粒细胞，分为生理盐水对照组（A组）、来普霉素B（LMB）干预组（B组）、LPS刺激组（C组）和LMB +LPS组（D组）。各组分别在刺激后120 min ，用 Western印迹检测细胞核、胞浆中IκBα含量，用NFκBp65试剂盒检测细胞核NFκB活性，流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡百分比。结果 C组胞浆及胞核中IκBα含量较A组中明显减少，而NFκB活性显著增加，中性粒细胞凋亡比例减少；D组胞核中IκBα含量较C组中明显增多， NFκB活性明显抑制，中性粒细胞凋亡比例增加。结论 IκBα的核内聚集可抑制NFκB活性，并促进炎症状态下中性粒细胞凋亡。

【关键词】 核转录因子κB;核转录因子κB抑制因子;中性粒细胞;凋亡

　　【Abstract】 Objective To invest the effect of nuclear transcription factorκB inhibitor on neutrophil apoptosis induced by lipopolysaccharide (LPS).Methods In vitro cultured neutrophil was pided into normal saline (NS)， leptomycin B(LMB)， LPS， LMB plus LPS groups respectively. After 120 min of stimulation， Western blot was applied to detect IκBαcontent in the nucleus and cytoplasm， NFκB activity of the nucleus was detected by NFκBp65 kit， neutrophil apoptosis percentage was determined by flow cytometer. Results In LPS group， the contents of IκBαin the nucleus as well as in the cytoplasm were much lower than those in NS group， whereas the activity of NFκB was higher and the neutrophil apoptosis percentage was decreased. Compared with that in LPS group， the content of IκBαin the nucleus of LMB plus LPS group was higher， and the NFκB activity was inhibited and neutrophil apoptosis percentage was increased.Conclusions IκBαin the nucleus can obviously restrain the NFκB activity and accelerate apoptosis of neutrophil under inflammatory condition.

　　【Key words】 Nuclear transcription factorκB; Inhibitor of nuclear transcription factorκB; Neutrophil; Apoptosis

　　急性肺损伤、急性胰腺炎等炎症反应过程中，中性粒细胞首先浸润于炎症灶中，并可能过度活化导致全身炎症反应综合征〔1〕。核转录因子κB（NFκB）作为多种介质的转录调控因子，不仅参与炎症介质的调控，同时也对中性粒细胞凋亡基因的表达调控有重要作用。因此，NFκB自身的活性状况对炎症进程有至关重要的作用。本研究通过脂多糖(LPS)刺激中性粒细胞，探讨NFκB天然抑制调节因子IκBα对中性粒细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　LPS、来普霉素B（leptomycin B，LMB）购自深圳晶美生物公司，IκBα单抗、Western印迹试剂盒购自武汉博士德公司，Trans AMTM NFκBp65 kit 为大连宝生物公司产品。细胞核浆蛋白制备试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。

　　1.2 中性粒细胞分离培养及细胞核、浆蛋白制备

　　2 w内未服用药物的健康成人志愿者（为献血员），参照文献〔2〕进行中性粒细胞分离纯化。纯化后的细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640溶液中至终浓度为5×109/L，于37℃振荡培养。将离体培养的中性粒细胞分为4组：（1）生理盐水对照组（A组）；（2）LMB干预组（B组）；（3）LPS刺激组（C组）；LMB+LPS组（D组）。LPS刺激的终浓度为0.1 g/L；LMB+LPS组中，予LPS刺激前45 min加入1‰（V/V）LMB。应用北京博奥森生物技术有限公司细胞核浆蛋白制备试剂盒提取核浆蛋白，步骤参照说明书进行。应用Bradford法测定制备蛋白浓度。

　　1.3 细胞核NFκB活性检测

　　采用Trans AMTM NFκBp65 试剂盒进行检测。以不加入核提取物为空白对照，实验组中每个时相点进行5次测定，读取分光光度计450 nm处A值进行统计学处理。

　　1.4 细胞核、浆IκBα含量检测

　　将提取的各组细胞核、浆蛋白进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）蛋白电泳。上样量20 μg，90 V电泳2 h后，电转至硝酸纤维素膜。5%（W/V）脱脂奶粉封闭1h，加入兔抗IκBα多克隆抗体（1∶200）4℃过夜，羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）室温下孵育1 h。应用化学发光试剂盒进行检测，凝胶图像分析系统扫描分析，并用测得目的条带的灰度×面积表示结果。

　　1.5 中性粒细胞凋亡的检测

　　采用流式细胞仪DNA倍体分析法：收集1×105个中性粒细胞，1 000 r/min离心5 min，弃培养液，用PBS液洗2次后加入70%冷乙醇2 ml混匀，4℃固定30 min。再以1 000 r/min离心5 min，弃培养液，用PBS洗2次后加入1 ml碘化丙啶（PI）染色，4℃孵育30 min，上机分析。

　　1.6 统计学处理

　　以SPSS10.0软件进行统计分析，以x±s表示，进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 细胞核NFκB活性检测结果

　　LMB干预组细胞核NFκB活性(0.041 2±0.003 1)与对照组(0.042 1±0.003 3)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。给予LPS刺激后，NFκB活性(0.622 0±0.053 6)较对照组显著增强(P＜0.05)；而给予LPS刺激的同时加入LMP，NFκB活性(0.050 0±0.003 6)明显受到抑制。

　　2.2 细胞核、浆IκBα含量检测结果

　　细胞核、浆IκBα Western印迹结果见图1。细胞核、浆IκBα凝胶图像扫描结果见表1。对照组、LMB干预组胞浆与胞核中IκBα含量无显著性差异；LPS刺激组中胞浆含量略低于胞核(P＜0.05)，且LPS刺激组胞浆及胞核中含量均低于对照组(P＜0.05)；LMB+LPS组胞浆明显低于胞核。表1 细胞核、浆IκBα凝胶图像扫描结果（略)

　　2.3 中性粒细胞凋亡检测结果

　　见图2。与对照组相比，LMB干预组中性粒细胞凋亡百分比无明显改变；而LPS刺激组显著下降(P＜0.05)。LMB+LPS组与LPS刺激组比较，中性粒细胞凋亡百分比明显上升(P＜0.05)。

　　3 讨 论

　　中性粒细胞作为机体内最活跃的炎症细胞，在脏器内大量扣押、活化是导致急性肺损伤等炎性疾病恶化的中心环节。激活的中性粒细胞通过呼吸爆发产生大量自由基、蛋白水解酶及炎症介质等有害物质造成组织损伤。适度清除中性粒细胞是控制炎症发展的重要措施。凋亡的中性粒细胞脱颗粒、呼吸爆发等致炎功能下降，而且更易被吞噬细胞吞噬。被整体吞噬的中性粒细胞致炎能力显著下降。因此，凋亡作为中性粒细胞重要的非炎性清除方式，对炎症疾病转归有重要作用〔3，4〕。

　　生理状态下，作为终末分化的中性粒细胞在外周循环中存活时间仅4～6 h，而炎症状态下其凋亡时间明显延长。研究表明，NFκB活化可能是中性粒细胞凋亡延迟原因之一〔5〕。NFκB作为最重要的核转录因子，一方面通过直接参与多种炎症介质基因转录调节，上调炎症介质的表达；另一方面，也可能通过中性粒细胞凋亡相关基因的表达调控，延迟中性粒细胞凋亡，从而间接加剧了炎症状态。NFκB参与中性粒细胞凋亡基因的表达调控的机制不甚明了。NFκB经典调节途径认为，未激活的NFκB以p50/65IκBα二聚体形式储存于胞浆中。在外界条件刺激下，IκBα发生磷酸化降解，导致p50/65核定位序列（NLS）暴露，NFκB发生核转位，从而启动多种基因转录〔6〕。

　　由于IκBα启动子上含NFκB结合位点，NFκB发生核转位后也启动IκBα转录，新合成的IκBα进入核内，促使NFκB从启动子上移位，从而对NFκB产生负反馈调节效应。然而，IκBα对NFκB调节存在高度组织特异性。本研究发现，对照组未受刺激的中性粒细胞胞浆和胞核中均存在大量的IκBα。这不同于文献报道的单核细胞等其他细胞IκBα只存在于胞浆中〔7〕。胞浆中合成的IκBα可能以某种机制自由穿梭于核、浆之间，从而使核浆之间含量呈现一致。LPS刺激下，C组胞浆及胞核中IκBα均明显低于对照组，炎症状态下IκBα发生明显降解；而胞浆与胞核之间也存在显著性差异，可能原因是降解只发生于胞浆中。
　　
　　LMB是从链霉菌中分离出来的一种不饱和支链脂肪酸，是一种有效的CRM1介导的出核的抑制剂。LMB和CRM1的一个保守的半胱氨酸巯基形成共价化合物，阻止CRM1和出核的目标蛋白出核序列（NES）相互作用。这种共价作用使IκBα等多种蛋白的出核活动受到抑制。然而，在LMB存在情况下，胞核、胞浆中IκBα与未加入LMB时无明显差异，未发现这种抑制活性。LMB对未受刺激中性粒细胞IκBα出胞活动及NFκB活性均无影响。炎症状态下，LMB对IκBα出胞活动具有明显抑制作用，使其聚集于胞内，从而使LMB+LPS组中NFκB活性较LPS组明显受到抑制，中性粒细胞凋亡比增加。

　　IκBα作为NFκB的天然抑制物，在未受刺激的中性粒细胞中存在一定基础合成，于胞浆内合成后，在核、浆间进行穿梭。受到前炎症介质刺激后，IκBα发生明显降解，予以出核抑制剂后，可使其聚集于核内，从而发挥NFκB抑制效应，进而促进中性粒细胞凋亡。因此，对IκBα出核抑制剂的进一步研究，有望为临床炎症性疾病的防治提供新的思路。

参考文献

　1 陈 炫，沙建平，汤绍辉，等.益活清胰I号对重症急性胰腺炎大鼠中性粒细胞与内皮细胞黏附的抑制作用〔J〕.中国微循环，2007；11（3）：1803.

　　2 颜 亮.一种高纯度多形核白细胞分离方法〔J〕.中国病理生理杂志，1997；6（13）：7701.

　　3 刘 韧，肖 南，田昆仑，等.中性粒细胞凋亡延迟在脂多糖所致大鼠急性肺损伤发病机制中的作用〔J〕.中华医学杂志，2001；81（10）：61721.

　　4 王晓龙，周向东.中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin在毕赤酵母中的表达及活性检测〔J〕.中国生物工程杂志，2006；26（12）：2933.

　　5 Nolan B，Kim R，Duffy A，et al.Inhibited neutrophil apoptosis：proteasome dependent NFκB translocation is required for TRAF1 synthesis〔J〕. Shock，2000；14(3):2904.

　　6 May MJ，Ghosh S.IκB kinases：kinsmen with different crafts〔J〕. Science，1999；284（4）：28471.

　　7 Vancurova I，Miskolci V，Davidson D.NFκB activation in tumor necrosis factor α stimulated neutrophils is mediated by protein kinase Cδ：correlation to nuclear IκB〔J〕.J Biol Chem，2001；276（7）：1974652.