多波长UVRB相干作用对视网膜光感受器损伤特点及损伤后的恢复

　　　　 作者：李亚萍 李光宇 刘早霞 苏冠方 孙大军

【摘要】 目的 研究不同波段UVRB相干作用对视杆细胞损伤的特点。方法 6 w龄albino SpragueDawley大鼠随机分成4组，每组20只。UVRB辐射光来自于与单色器相连的高压银汞灯，最大的输出能量在300 nm (UVRB300 nm) 和 310 nm (UVRB310 nm)。每只动物暴露1只眼，2组只暴露于UVRB300 nm， 剂量: 8 kJ/m2，时间为70 min;另2组先暴露于UVRB300 nm， 剂量4 kJ/m2，时间35 min;然后同一只眼再暴露于UVRB310 nm， 剂量42 kJ/m2，时间35 min。于暴露后第3、8天，处死动物。分别行光镜和电镜检查。结果 与其他2组比较，UVRB300 nm+310 nm暴露后第8天部分视杆细胞丧失，但同时视杆细胞外节盘膜(ROS)却逐渐恢复（P<0.05）。UVRB300 nm+310 nm组暴露后第8天与第3天比较，ROS水肿明显减轻，ROS变短；内节盘膜长短和排列恢复；视网膜外核层染色质密度多数恢复，少数发生核固缩；RPE内空泡状吞噬小体已不见。结论 不同波段UVRB相干作用后，视网膜视杆细胞可能存在恢复机制，但这种损伤修复过程相当缓慢。其机制可能是细胞适应性反应，也可能是慢性细胞损伤。

【关键词】 视网膜视杆细胞；UVRB；相干作用；生物学效应

太阳光中300 nm左右UVRB的生物学效应很强，Laube〔1〕报道其可以穿过透明晶体到达视网膜。随UVRB辐射强度的增加，对人视网膜的损伤也逐渐加重。光损伤首先引起光感受器的改变，然后是视网膜色素上皮(RPE)的损害，但损伤视杆细胞还是视锥细胞取决于不同的物种，在大鼠主要损伤视杆细胞。视杆细胞光损伤开始于内、外节盘膜，如果损伤严重可导致视杆细胞死亡；如损伤轻微，通过损伤修复机制，其结构将恢复〔2〕。本研究旨在探讨视杆细胞外节盘膜(ROS)是否可从UVRB的损伤中恢复。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物

　　所有shalbino SpragueDawley雌性大鼠购自M&B Denmark，保存在可调温动物室，每天12 h灯光照明（平均照明度5 lux），12 h黑暗；动物适应喂养直到6周龄用于实验。所有大鼠都按ARVO的眼、视光学研究条例进行饲养和实验操作。

　　1.1.2 UVR光源

　　辐射光来自于350 W的高压银汞灯，直射出的辐射线首先经过水冷却，然后经过两个单色器（λmax=300 nm with 10.1 nm full width at half maximum〔FWHM〕;λmax=310 nm with 13.5 nm FWHM）。最后辐射光照在角膜上。在角膜水平，辐射光被热电器(model 7101; Oriel，Stratford， CT)测量。热电器测量标准由美国国家计量局建立。

　　1.2 分组

　　80只6 w龄大鼠随机分成4组。其中2组的每只大鼠右眼活体暴露于UVRB300 nm，剂量8 kJ/m2 ，时间70 min；一组在暴露后3 d被处死，另一组在暴露后8 d被处死。另2组中的每只大鼠右眼活体暴露于UVRB300 nm，剂量4 kJ/m2，时间35 min；然后同一只眼再暴露于UVRB310 nm，剂量42 kJ/m2，时间35 min；一组在暴露后3 d被处死，另一组在暴露后8 d被处死。每一只大鼠左眼没有光暴露。

　　1.3 方法

　　每只大鼠为以95 mg/kg ketamine和14 mg/kg xylazine混合腹腔注射麻醉5 min后，1%散瞳剂tropicamide 1滴滴双眼。5 min后，固定动物右眼上下眼睑，右眼暴露于UVRB。分别于光暴露后第3、8天以过量的CO2处死大鼠，剜出双眼，去除眼球前节组织和玻璃体，以视盘为中轴纵形垂直剖开眼球，再以视盘为中心水平将颞侧半眼球剖开成2份（各1/4眼球大小），一份置于10%中性福尔马林溶液中，另一份置于3%戊二醛溶液中固定。分别行光镜和电镜检查。

　　1.4 光镜和电镜检查

　　光镜观察的标本用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜进行观察。电镜观察的标用1%四氧化锇后固定，切片，双氧铀醋酸铅柠檬酸盐环氧染色后，用JEM100电镜进行观察。

　　1.5 统计学方法

　　采用SAS软件，数据处理采用秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 组织形态学变化

　　UVRB300 nm暴露后3 d组，颞侧ROS与非暴露眼无明显差别（图1A、1B）。UVRB300 nm+310 nm暴露后3 d组，颞侧ROS明显水肿，外节盘膜间的空隙增大；内节盘膜略短，并有空泡形成；视网膜外核层（ONL）染色质密度增浓（核固缩早期）；RPE内见空泡状吞噬小体形成（图1C）。UVRB300 nm暴露后8 d组，颞侧ROS与非暴露眼无明显差别。UVRB300 nm+310 nm暴露后8 d组，颞侧ROS水肿明显减轻，在ROS末梢仍可见水肿；ROS变短；内节盘膜长短和排列恢复；视网膜ONL染色质密度多数恢复，但有少数发生核固缩；RPE内空泡状吞噬小体已不见（图1D）。UVRB300 nm+310 nm暴露后8 d组超微结构显示，颞侧ROS顶部明显恢复，显示出规律排列，见图2。表1 暴露于UVRB对ONL厚度的影响(略)

　　2.2 ONL厚度和ROS长度变化

　　UVRB300 nm+310 nm暴露3 dEY 8 d组，ONL厚度均明显降低（均P＜0.05），共中暴露8 d组ONL厚度降低12%～13%。UVRB300nm暴露后3、8 d组，ONL厚度降低不明显（P＞0.05）(表1)。UVRB300 nm+310 nm暴露3 d组，ROS长度减少不明显（P＞0.05）。UVRB300 nm+310 nm暴露8 d组，ROS长度减少32%（P＜0.05）。UVRB300 nm暴露后3、8 d组与非暴露眼比较，ROS长度无明显变化（P＞0.05）(表2)。表2 暴露于UVRB 对ROS 长度的影响(略)

　　3 讨 论

　　在一定的条件下，光损伤后的光感受器细胞是可以恢复的。光损伤恢复的程度和时间取决于最初的光损伤严重程度。如果是轻微的损伤，ROS可再生。这就提示光感受器细胞的生理再生机制并没有受到损伤，ROS的损伤可以修复。但是损伤严重时，光感受器细胞恢复的过程相当缓慢〔3，4〕。本研究UVRB300 nm暴露组，ROS无明显损伤。UVRB在300 nm的波段可完全被晶体吸收，没有到达视网膜。而UVRB310 nm可以透过晶体到达视网膜，发生光损伤。UVRB300 nm+310 nm暴露后8 d ROS顶部明显恢复，显示出规律排列。这显示出ROS的结构和功能有了一定的恢复。Rapp〔5〕提出UVRA暴露后ROS中视紫红质下降，随后在暗室中又有缓慢恢复。另一研究显示蛋白质prenylation对维持ROS结构有重要作用〔6〕。
　
　　光感受器细胞的丧失表现在ONL厚度降低，UVRB300 nm+310 nm暴露3 d后，在视网膜ONL发现核固缩；UVRB300 nm+310 nm暴露8 d后，ONL厚度降低12%～13%。O′Steen等〔7〕报道大鼠活体眼在荧光灯下暴露24 h，1 d后光感受器细胞发生渐进性丧失。UVRB310 nm暴露使光感受器细胞丧失，同时光感受器细胞的ROS却逐渐恢复。目前原因还并不清楚，但光损伤后刺激细胞生长的抗氧化剂和神经生长因子可能起到一定作用〔8〕。ROS恢复的时间是10 d，光损伤后ROS更新的速度更加缓慢，大概是光暴露后17 d，而结构完全恢复正常可能还需2～3 w。但恢复一段时间后的ROS可能还是短的，这说明光感受器细胞的恢复不仅慢，而且ROS的长度和组织结构并不能完全恢复。
　　
　　光损伤机制可能因为UVRB干扰光感受器细胞的代谢，光感受器外节盘膜含有大量的多链不饱和脂肪酸，当辐射损伤时产生自由基，使光感受器细胞核损伤，发生染色质密度增加，严重者可发生核固缩，致ONL厚度减少。在细胞水平，光辐射在视杆细胞内、外节盘膜诱导视紫红质参与的光损伤〔5，9〕，caspase3在视网膜外核层上调，细胞色素C从线粒体释放〔10〕，损伤线粒体DNA，使ROS的形成、长度的恢复功能下降。本研究发现视网膜ONL染色质密度增浓（核固缩早期）。其次是“适应”机制，光感受器细胞逐渐适应光强度情况下，为维持细胞的生存，被用于更新的能量可能转而用于修复内节盘膜。最后是“反馈”机制，RPE细胞吞噬ROS后，RPE细胞的线粒体DNA损伤，自由基破坏了溶酶体功能，导致抑制ROS的合成。本研究发现RPE内见空泡状吞噬小体形成。此外ROS的缩短，可能保护光感受器细胞免于光损伤。因为在强光下饲养的大鼠ROS变短，光感受器细胞无明显的光损伤。

参考文献

　1 Laube T， Apel H， Koch HR. Ultraviolet radiation absorption of intraocular lenses〔J〕. Ophthalmology， 2004;111:8805.

　　2 Rapp LM， Smith SC. Morphological comparisons between rhodopsinmediated and shortwavelength classes of retinal light damage〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci， 1992;33:336777.

　　3 Sderberg PG. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation〔J〕. Acta Ophthalmol (Copenh)， 1990;68:177.

　　4 Wixson SK，White WJ，Hughes HC. A comparison of pentobarbital， Fentanyl droperidol， ketaminediazepam anesthesia in adult male rats〔J〕. Lab Anim Sci， 1987;37:72630.

　　5 Rapp LM， Ghalayini AJ. Influence of UVA light stress on photoreceptor cell metabolism: decreased rates of rhodopsin regeneration and opsin synthesis〔J〕. Exp Eye Res， 1999;68(6):75764.

　　6 Pittler SJ， Fliesler SJ， Fisher PL， et al. In vivo requirement of protein prenylation for maintenance of retinal cytoarchitecture and photoreceptor structure〔J〕. J Cell Biol，1995;130(2):4319.

　　7 O’steen WK， Donnelly JE. Chronologic analysis of variations in retinal damage in two strain of rats after shortterm illumination〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci，1982;22:2525.

　　8 Organisciak DT， Darrow RM， Bicknell IR， et al. Proctection against retinal light damage by natural and synthetic antioxidans〔M〕. In: Anderson RE， Hollyfield JG， LaVail MM ，eds. Retinal Degenerations. Boca Raton. CRC Press，1992:189201.

　　9 Demontis GC， Longoni B， Marchiafava PL. Molecular steps in lightinduced oxidative damage to retinal rods〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci，2002;43:24217.

　　10 Wu J， Gorman A， Zhou X ，et al. Involvement of Caspase3 in photoreceptor cell apoptosis induced by in vivo blue light exposure〔J〕. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2002;43:334954.