雷公藤内脂醇诱导Hep2细胞凋亡及对细胞增殖周期的影响

【摘要】 目的 观察雷公藤内酯醇（TL）诱导人喉癌细胞株（Hep2细胞株）的增殖抑制率、细胞凋亡率及其对细胞增殖周期各时相的影响。方法 应用噻唑蓝（MTT）染色法检测Hep2细胞的增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化及凋亡率，吖啶橙染色计算凋亡率及形态学改变。结果 不同浓度的TL对Hep2细胞增殖均有抑制作用，呈剂量依赖性。流式细胞仪结果显示，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，吖啶橙染色可见细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高。结论 TL对Hep2细胞有显著的增殖抑制作用，抑制Hep2细胞G1期向S期的转化进程，诱导Hep2细胞凋亡。

【关键词】 Hep2细胞；雷公藤内酯醇；细胞周期；凋亡

　肿瘤细胞凋亡调控失调导致的细胞凋亡抵抗（resistance to apoptosis）是肿瘤发生的主要原因之一，细胞凋亡可被多种生理、病理刺激所诱发，是细胞对所处环境的一种应答反应。因此，应用化学诱导剂克服肿瘤细胞凋亡抵抗的新方法进入临床试验〔1〕。研究表明雷公藤内脂醇（tritolide，TL）对白血病、肺癌、膀胱癌等多种肿瘤细胞具有广谱的细胞毒效应〔2〕，但对头颈部肿瘤还未见报道。为此，本文应用Hep2细胞为靶点，观察TL对Hep2细胞增殖周期及凋亡率的改变，旨在为头颈部肿瘤的治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞及试剂

　　Hep2细胞株由吉林省肿瘤医院惠赠；四氮唑蓝（MTT）试剂及基础培养液（IMDM）培养基(美国Sigma公司)；TL(中国药品检测所)；胎牛血清(长春生物制品研究所)。

　　1.2 MTT染色法

　　取指数生长期的Hep2细胞、调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内，每孔100 μl，细胞增殖达到80%融合时每孔内分别加入不同浓度的TL溶液1、3、5 μg/ml，每个浓度10复孔，静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度500 mg/L，继续培养6 h后弃上清，加入二甲基亚矾（DMSO）溶液150 μl/孔，振荡5 min，使MTT还原产物完全溶解。用酶标仪在570 nm处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算Hep2细胞增殖抑制率。Hep2细胞抑制率=（1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值）×100%。

　　1.3 流式细胞术法

　　细胞培养及分组同1.2，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 ml培养瓶进行，培养结束后用0.25%胰蛋白酶消化，分别收集细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，70%冷乙醇固定，上机前过40目网，调细胞数1×106/ml，碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Modifi 2.0软件分析。

　　1.4 Hep2细胞荧光染色

　　细胞培养及分组同1.2，培养结束后将荧光染料直接滴入96孔培养板内，荧光染料浓度为吖啶橙（AO）100 mg/ml，溴化乙啶（BB）100 μg/ml等量混合，每孔50 μl，然后在荧光显微镜下观察并拍照。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据统计处理采用SPSS 11.0软件，细胞生长抑制率组间比较采用χ2检验，凋亡率和细胞周期组间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 MTT染色结果

　　不同浓度的TL对Hep2细胞增殖均有影响，随着药物浓度升高，抑制率增加，具有明显的剂量依赖性，与对照组相比差异非常显著（P＜0.01）。见表1。表1 不同浓度的TL对Hep2细胞增殖抑制率的影响(略)

　　2.2 流式细胞术检测结果

　　不同浓度的TL对Hep2细胞周期各时相均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，凋亡率(AP)升高，组间比较差异显著。见表2。表2 不同浓度TL对Hep2细胞周期各时相及凋亡率的影响(略)

　　2.3 Hep2细胞荧光染色结果

　　不同浓度的TL对Hep2细胞均有促进凋亡作用，凋亡率升高，荧光染色显示1、3、5 μg/ml TL对Hep2细胞凋亡率分别为6%、7.6%、17.4%，具有明显的剂量依赖性。见图1。

　　3 讨 论

　　TL又称雷公藤甲素，是从卫矛科植物雷公藤中提取的一种主要活性成分，有抗炎、抗免疫、抗肿瘤、抗菌等作用〔3〕，且能与多种化疗药物协同作用，强化化疗效果或逆转肿瘤细胞耐药。本文应用MTT染色法检测3组不同浓度TL对Hep2细胞的增殖抑制率分别为19.8%、27.9%和46.9%，具有明显的剂量依赖性。流式细胞仪结果显示，不同浓度的TL对Hep2细胞周期各时相均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，有文献报道TL能使细胞周期阻滞于G0/G1期〔4〕。G0/G1期细胞又称细胞复制前期，是指细胞从有丝分裂到DNA复制之前，G1期制造和产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，同时G1期糖元合成最为显著，而且G1期也是化学药物作用的敏感点〔5〕。因此，抑制细胞周期G1期的RNA及核蛋白体的合成，可间接使肿瘤细胞的RNA合成减少。实验结果显示TL可明显阻滞G1期细胞向S期转化，使S期细胞减少，从而造成G2/M期相对增多，而G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应，这一点从细胞凋亡率上得到了体现，与文献报道一致〔6〕。

　　本实验应用免疫荧光技术检测不同浓度TL对Hep2细胞凋亡表达，结果表明Hep2细胞凋亡率与TL浓度成正相关。本研究采用BB和AO两种荧光染料复合染色，BB为啡啶类染料，可嵌入多核苷酸结构，活细胞膜可排斥BB穿透，而坏死细胞易穿透；AO可穿透活细胞膜细胞被染绿色，细胞凋亡时，细胞缩小，核固缩，染色深，呈黄色，而死亡细胞被染成均匀红色，通过荧光显微镜极易区分开凋亡细胞、死亡细胞和正常细胞。总之，TL对Hep2细胞有较强的增殖抑制作用，抑制细胞周期的转化进程，诱导凋亡，发挥较强的抗肿瘤活性。

参考文献

　1 杨志宏，王智彪.细胞凋亡信号转导与肿瘤细胞凋亡抵抗机制〔J〕.国外医学·国外肿瘤学肿瘤分册，2004；31(8)：57981.

　　2 宁维翔，顾江红.雷公藤内脂醇抗肿瘤作用研究进展〔J〕.国际肿瘤学杂志，2006；33（1）：269.

　　3 丁晓凌，周国雄.雷公藤内脂醇诱导肿瘤细胞凋亡的机制〔J〕.国际肿瘤学杂志，2006；33（4）：25961.

　　4 Yang S，Chen J，Guo Z，et al.Triptolide inhibits the growth and metastasis of solid tumors〔J〕.Mol Cancer Ther，2003；2(1):6572.

　　5 Brtek J，Lukas J.Mammalian G1 and Sphase checkpoints in response to DNA damage〔J〕.Currnopin Cell Biol，2001；13(6):73847.

　　6 Ellinger ZH，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20like kinase(SLK)，a regulatory kinase for pololikekinase(PIK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2000；5(6):4918.