多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP1、MMP3表达的影响

　　　　　　 作者：张冰洁 郝继龙 卢佳 吴雅臻

【摘要】 目的 探讨多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素（IL）1α对人角膜基质细胞MMP1、3表达的影响。方法 体外培养人角膜基质细胞，在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL1α，培养5 d，通过免疫印迹分析法测定培养上清中的MMP1、3的表达。结果 在无任何刺激下人角膜基质细胞不表达MMP1、3;添加IL1α后可诱导前体MMP1、3表达，而添加多核白细胞弹性蛋白酶不能诱导MMP1、3的表达；多核白细胞弹性蛋白酶可激活在IL1α诱导下产生的前体MMP1、3转化为活化形式的MMP1、3。结论 多核白细胞弹性蛋白酶和IL1α可协同诱导角膜基质细胞的胶原降解，诱发角膜溃疡的发生。

【关键词】 多核白细胞弹性蛋白酶；白细胞介素1α；角膜基质细胞；MMP1；MMP3

　　【Abstract】Objective To understand the mechanism of corneal ulceration by investigating the role of neutrophil elastase (NE)，interleukin (IL)1α and corneal fibroblasts on expression of matrix metalloproteinases（MMP）1 and 3 in cultured human corneal fibroblasts. Methods NE or IL1α was added to culture medium of human corneal fibroblasts 5 d later. The activity of MMP1 and 3 were examined by immunoblot analysis. Results Cultured human corneal fibroblasts didn′t release MMP1 and 3 without any stimulation. IL1α induced the expression of proMMP1 and 3， NE transformed proMMP1 and 3 into active forms induced by IL1α. Conclusions NE and IL1α can coinduce human corneal fibroblasts in collagen degradation.

　　【Key words】Neutrophil elastase; Interleukin1α; Human corneal fibroblasts; MMP1; MMP3

　　角膜基质细胞存在于规则排列的基质胶原纤维之间，对于维持角膜基质胶原代谢及自身稳定起着重要作用。角膜基质细胞可产生多种基质金属蛋白酶（MMPs）〔1〕，这些MMPs均以酶原的形式分泌到细胞外，在细胞外被激活后才具有酶解作用〔2〕，可裂解细胞外基质（ECM）、胶原等。如果MMPs过度表达，就会引起胶原过度降解，进而形成角膜溃疡〔1〕。而在角膜溃疡时角膜基质内可见大量的多核白细胞浸润，多核白细胞可以通过释放过氧化氢、自由基、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶和明胶酶等导致角膜病理性的组织损伤。本文利用免疫印迹分析的方法观察多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素1α(IL1α)介导下对人角膜基质细胞MMP1、3表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 人角膜基质细胞的分离培养及鉴定

　　人角膜取自于意外死亡的眼球捐献者，供体角膜中央部分用于穿透性角膜移植，残余周边部分用于本试验。按以前报告的方法〔3〕将供体角膜残余部分自角膜缘内1 mm剪开，去除角膜缘及巩膜部分，刮除角膜上皮及内皮，角膜基质以胶原酶消化，分离角膜基质细胞，原代培养于含10%胎牛血清 MEM 培养液中，传代培养4～5代的细胞用于实验。

　　1.2 人角膜基质细胞的鉴定

　　实验前倒置显微镜下观察角膜基质细胞形态，细胞的鉴定采用抗波形蛋白（Vimentin）抗体（非上皮细胞标志）、抗细胞角蛋白（Cytokeratin）抗体（上皮细胞表面标志）、抗α平滑肌抗体（SMA）（肌样成纤维细胞表面标志）行免疫染色〔4〕。

　　1.3 免疫印迹分析法检测MMP1、3的表达

　　将角膜基质细胞以0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，稀释至约1×104 ml-1后置入6孔板培养至80%融合，换成不含有血清的MEM培养液培养1 d，使细胞达到同步化。添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶（30 nm，Sigma，美国）或IL1α（0.3 ng/ml，Genzyme，美国）的无血清MEM 培养液培养5 d。收集上清备用。配制10%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酸胺凝胶，在4℃进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），过水洗净后转膜，NC膜作好记号后37℃封闭2 h，加入绵羊抗人 MMP1、3抗体室温下于摇床孵育2 h，以ECL试剂盒 (Amersham， Little Chalfont， UK)测定免疫复合物反应。

　　2 结 果

　　在无角膜基质细胞情况下，无论血清中是否添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL1α均不能检测到MMP1、3的表达。人角膜基质细胞培养基中无任何添加或单纯添加多核白细胞弹性蛋白酶时，均不能检测到MMP1、3表达；而单纯添加IL1α后可诱导前体MMP1（52 kD）、3（57 kD）的产生；同时添加IL1α和多核白细胞弹性蛋白酶时可诱导前体MMP1、3转化为活化形式的MMP1（20 kD）、3（45 kD）（图1）。

　　3 讨 论

　　角膜基质细胞可分泌多种MMPs，这些MMPs被激活后可发挥酶解作用，导致角膜溃疡的发生。目前MMPs家族被分为四类：胶原酶、明胶酶、间质溶素和膜型金属蛋白酶。MMP1作为胶原酶的一种可特异地作用于Ⅰ和Ⅲ型胶原的三螺旋区，裂解其氨基末端α1链中的甘氨酸和异亮氨酸肽键，最终使胶原分子降解〔5〕。MMP3又称间质溶素1，激活后不仅能广泛降解ECM，也可降解完整的基底膜Ⅳ型胶原〔6〕，更重要的是它能激活其他MMPs一起参加ECM降解〔7〕。多核白细胞释放的多核白细胞弹性蛋白酶可降解许多种ECM蛋白如弹性蛋白、糖蛋白、胶原、纤维连接蛋白等。

　　本文结果显示在无任何刺激下人角膜基质细胞不表达MMP1、3，添加IL1α后可诱导前体MMP1、3表达，这与我们报告的存在纤维溶酶原时IL1α可促进角膜基质细胞胶原降解〔8〕的结论一致。有报道多核白细胞弹性蛋白酶能活化MMP1产生分子量为42和20 kD的活性片段〔9〕，同时可诱导MMP3 变成分子量45 kD的片段〔10〕，此片段才真正具有生物活性〔11〕，并且多核白细胞可在IL1β介导下诱导人肺成纤维细胞产生活化的MMP1、3〔12〕。本文多核白细胞弹性蛋白酶可激活IL1α诱导下产生前体MMP1、3转化为活化的MMP1、3的结果与上述报道相符，未检测到MMP1的42 kD的活性片段，可能是该片段被蛋白酶进一步分解所致。以上结果提示在角膜溃疡的发生中多核白细胞弹性蛋白酶和IL1α起到协同作用，促进角膜胶原降解进而加重病情进展。

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