大鼠急性脊髓损伤热休克蛋白47的表达变化

　　　　　　作者：何玉宝 杨晨 杨有庚 任宪盛

【摘要】 目的 研究老年大鼠急性脊髓损伤（SCI）中热休克蛋白47(HSP47)的表达情况。方法 用54只Wistar大鼠制作钳夹型SCI模型，在SCI后3 d及每周评价BBB评分，并在1、3、5 w用免疫组化方法分析脊髓中HSP47的表达情况。结果 正常Wistar大鼠脊髓组织低表达HSP47，在SCI后表达明显提高，且在第5周仍有上升趋势（P＜0.01）。脊髓损伤后灰质、白质分界不清，细胞凋亡明显，HSP47主要在血管及靠近软脊膜处白质中表达。结论 老年Wistar大鼠SCI 后HSP47表达增加，HSP47可能参与到SCI的病理改变过程中。

【关键词】 急性脊髓损伤；热休克蛋白47；钳夹型急性脊髓损伤模型

老年患者由于脊柱和间盘的退行性改变，急性脊髓损伤（SCI）发病危险更高。胶质瘢痕是脊髓损伤修复的阻碍因素之一〔1〕，而热休克蛋白47（HSP47）在瘢痕形成的过程中起到重要的作用〔2〕。但是对于HSP47在SCI后的表达情况国内外文献尚未见报道。本研究拟通过免疫组化技术研究SCI后HSP47的改变，探索治疗脊髓损伤的新靶点。

　　1 资料与方法

　　1.1 实验动物

　　Wistar大鼠（清洁级）54只，鼠龄12个月，体重200～250 g，吉林大学实验动物中心提供。

　　1.2 实验试剂及仪器

　　HSP47（1∶200，Santa Cruz公司），胶质细胞酸性蛋白(GFAP，1∶50）、神经丝蛋白(NF，1∶100，武汉博士德生物工程有限公司)，UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒（鼠/兔）、DAB显色试剂盒（福州麦新生物技术开发有限公司），多聚赖氨酸（北京中杉金桥生物技术有限公司），甲苯胺蓝（北京化学制剂公司），石蜡配量机、石蜡包埋机、手动轮转切片机（德国LEICA公司）等。

　　1.3 大鼠钳夹型SCI模型的建立〔3〕

　　54只大鼠随机分为正常组，假手术组，SCI组，每组18只。假手术组单纯行T10椎板减压；SCI组接受T10节段的脊髓钳夹损伤。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g体重)，麻醉满意后，取俯卧位，固定，以肋骨下缘为中心背部剪毛，消毒，按肋骨确定椎体序列，在T8～T12水平剪开皮肤，长约3 cm。剪开深筋膜，尖刀紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌，直达椎板表面，显露出T9～T11的椎板和棘突，直至关节突。上自动撑开器，血管钳固定T9～T10棘突，蚊式止血钳咬除棘突、椎板至关节突内侧面，暴露出脊髓硬脊膜，并用动脉夹钳夹脊髓，发现钳夹后尾巴抽搐瘫痪。明胶海绵止血彻底后局部撒青霉素粉末20万U，逐层缝合肌肉、深筋膜、皮肤，再次消毒。术后分笼饲养，每日2次人工排尿，直至恢复排尿，大约2～3 w。青霉素每次5万U/100 g体重，2次/d，腹腔注射1 w。

　　1.4 BBB评分〔4〕

　　所有动物分别在SCI后3 d及每周评价BBB评分。将动物置于直径为2 m的圆形平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分3部分：第1部分为0～7分，评判动物后肢各关节活动；第2部分为8～13分，评判后肢的步态及协调功能；第3部分为14～21分，评判运动中爪的精细动作，3项满分为21分。

　　1.5 HE染色、尼氏染色和免疫组化染色

　　正常组、假手术组和SCI组在1、3和5 w分别处死6只。10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g体重)，达深度麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管至升主动脉，切开右心房，快速灌注100 ml 0.01 mmol/L PBS缓冲液冲洗血管，待右心耳留出液体基本无色，继以150 ml含10%中性福尔马林缓冲液灌注固定。自背部打开椎管，取出脊髓损伤区为中心的脊髓组织长约2 cm，并以10%中性福尔马林缓冲液4℃下固定24 h后，以脊髓损伤区为中心修块，长约3 mm。然后各级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。切片机以脊髓损伤区为中心切片，片厚2.0 μm。切片脱蜡至水，行HE、尼氏染色和SP法染色〔5〕。各级酒精脱水、二甲苯透明、树胶固封。用0.01 mmol/L PBS缓冲液代替一抗做阴性对照。

　　1.6 HE染色、尼氏染色和免疫组化染色结果判定

　　HE染色后细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。尼氏染色后尼氏体呈紫蓝色，胞核呈蓝色。免疫组化阳性表达为胞浆内或者轴突内出现棕黄色颗粒。在低倍镜（10倍）下选取阳性表达密集区，在高倍镜（400倍）下观察细胞形态、染色定位和程度。每个时间点选取6张切片，每张切片随机选取5个不同重叠视野，输入计算机分析累积光密度值。

　　1.7 统计学分析

　　实验数据均以x±s表示，采用LDS检验法对结果进行统计分析，结果由SPSS13.0输出。

　　2 结 果

　　2.1 BBB评分

　　正常组和假手术组大鼠双后肢BBB评分均为21分，SCI组损伤后3 d BBB评分为0.67±0.48，表明SCI模型成功；随着时间延长，评分逐渐上升，表明损伤正在修复，见图1。

　　2.2 免疫组化结果

　　见图2。HE、尼氏染色可见正常组和假手术组脊髓灰质呈典型的蝴蝶形状，灰质和白质边界清晰，而SCI组脊髓正常形态消失，空腔形成，灰质和白质分界消失，神经纤维排列紊乱、减少，神经细胞变性、坏死、凋亡，胶质细胞增生。HSP47主要表达在血管周围及靠近软脊膜处白质中。免疫组化累积光密度值分析见表1。与正常组和假手术组相比，SCI组HSP47表达水平高，且随时间的改变表达量增加（P＜0.05）。表1 各组大鼠脊髓中HSP47光密度的比较（略)

　　3 讨 论
　　
　　SCI后血管完整性和通透性遭到破坏，血管周围增加的Ⅰ型胶原一方面占据了本来就很狭小的椎管空间，另一方面阻碍重建的血管与周围细胞氧和营养物质的交换，在血管重建过程中起到阻碍的作用。Ⅰ型胶原的生成利于胶质瘢痕的形成而妨碍了脊髓神经元的轴突再生，不利于轴突穿过胶质瘢痕。
　　实验已经证明HSP47和胶原合成有关〔6〕。研究表明在内质网中，HSP47不仅参与Ⅰ型胶原的正确折叠，而且还阻止不正确折叠。HSP47在随后Ⅰ型胶原的分泌、加工和纤维化形成中起关键作用；在HSP47/细胞中应用基因敲除技术证明了HSP47在Ⅰ型胶原分子成熟中的重要性〔7〕。

　　SCI后尽管出现了细胞变性、坏死和凋亡，细胞数目减少，但是HSP47表达明显升高，主要分布在血管周围及靠近软脊膜处白质中，进一步证实了HSP47的表达增加阻碍了血管的再生。SCI后第1周HSP47即出现升高趋势，且在第5周仍有上升趋势，说明针对HSP47为靶点的治疗应该在SCI后立即给予干预，且应该持续到第5周以上。

参考文献

　　1 XiaY，Zhao T，Li J，et al.Antisense vimentin cDNA combined with chondroitinase ABC reduces glial scar and cystic cavity formation following spinal cord injury in rats〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;377(2):5626.

　　2 Takashi T，Razzaque MS. The collagenspecific molecular chaperone HSP47: is there a role in fibrosis〔J〕? Trends Mol Med，2006;13(2):4553.

　　3 Kao CH，Chen SH，Chio CC，et al.Exogenous administration of glial cell linederived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injury〔J〕.Resuscitation，2008;77(3):395400.

　　4 Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats〔J〕.J Neurotrauma，1995;12(1):121.

　　5 屈淑贤，谢晓冬，郑振东，等.免疫组化SP法检测人乳腺癌组织中VEGF和VEGFC的表达及意义〔J〕.现代肿瘤医学，2007;15(11):15824.

　　6 Razzaque MS，Taguchi T.Pulmonary fibrosis:cellular and molecular events〔J〕.Pathol Int，2003;53(3):13345.

　　7 Ishida Y，Kubota H，Yamamoto A，et al.Type I collagen in Hsp47null cells is aggregated in endoplasmic reticulum and deficient in Npropeptide processing and fibrillogenesis〔J〕.Mol Biol Cell，2006;17(5):234655.