针灸对SAMP8小鼠皮层神经干细胞增殖分化的影响

　　　　 作者：乔秀兰 卢圣锋 尹海燕 黄梅 曾芳 魏焦禄 余曙光 唐勇

【摘要】 　　目的 探讨针刺、艾灸对快速老化小鼠（SAMP8）皮层NSC增殖分化的影响。方法 选用8月龄SAMP8雄性小鼠随机分为模型组、针刺组、艾灸组，以同龄雄性正常老化小鼠（SAMR1）为对照组。针刺组、艾灸组选用“百会”进行治疗，每天治疗1次，7 d为1个疗程，共治疗3个疗程。对照组和模型组每天在相同时间给予相同方式的抓取。处死前1 w开始给予BrdU腹腔注射，50 mg/kg ；治疗结束后，取皮层，用免疫荧光双标方法检测神经干细胞(NSC)增殖、分化。结果 （1）各组小鼠均存在皮层NSC增殖。与对照组比较，模型组、针刺组、艾灸组阳性细胞数减少（P＜0.01，P＜0.05）；但模型组与针刺组、艾灸组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）各组小鼠均存在皮层NSC分化。与对照组相比，模型组NSC分化为神经元较少（P＜0.01，P＜0.05）、分化为胶质细胞较多（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组相比，针刺组NSC分化为神经元较多（P＜0.05）、分化为胶质细胞较少（P＜0.01，P＜0.05）；艾灸组NSC分化为未成熟神经元较多（P＜0.05）、分化为成熟星形胶质细胞（P＜0.01）和少突胶质细胞较少（P＜0.05）。结论 针刺、艾灸治疗3个疗程后，主要反映在促进NSC向不同方向分化的差异。其中，针刺主要促进SAMP8皮层NSC向神经元分化，抑制向胶质细胞分化；艾灸主要是促进其向未成熟神经元分化、抑制向成熟星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。

【关键词】 针刺；艾灸；快速老化小鼠；皮层；神经干细胞；增殖；分化

　　【Abstract】 Objective To investigate the influence of acupuncture and moxibustion on neural stem cell(NSC) proliferation and differentiation in senescenceaccelerated mouse prone 8 (SAMP8) cortex. Methods SAMP8 were randomized into model，acupuncture and moxibustion groups，SAMR1 were used as control group. Acupuncture and moxibustion therapy were applied on “Baihui(Du20)” once daily for 21 d. All the mice were given BrdU(50 mg/kg) intraperitoneal injection daily for 7 consecutive days before sacrificed; NSC proliferation and differentiation in cortex were detected by immunofluorescent double labeled staining. Results ①NSC proliferation was founded in all groups. Compared to that of SAMR1 group， the number of NSC positive cells was decreased in SAMP8， acupuncture and moxibustion groups (P＜0.01， P＜0.05， P＜0.05) without significant difference among the latter three groups(P＞0.05). ②NSC differentiation was identified in every group. The number of neurons differentiated from NSC in SAMP8 group was decreased significantly than that in SAMR1 group (P＜0.01， P＜0.05) while that glial cells were increased (P＜0.01， P＜0.05). Compared to that of SAMP8 group， the number of which NSC differentiated into neurons was increased significantly (P＜0.05) while that differentiated into glial cells was decreased(P＜0.01， P＜0.05) in acupuncture group; the number of which NSC differentiated into immature neurons was increased significantly (P＜0.05) while differentiated into mature astrocytes(P＜0.01) and oligodendrocytes decreased(P＜0.05) in moxibustion group. Conclusions The persity of NSCs differentiation are different between which accepted acupuncture and moxibustion different stimulation. Acupuncture could promote NSCs differentiated into neurons and inhibit them differentiated into glial cells after 3 courses of treatment while moxibustion prone to promote NSCs differentiated into immature neurons and inhibit them differentiated into astrocytes and oligodendrocytes.
　　
　　【Key words】 Acupuncture；Moxibustion；Senescenceaccelerated mouse prone 8(SAMP8)；Cortex; Neural stem cell(NSC)；Proliferation；Differentiation

　　正常情况下内源性神经干细胞(neural stem cells，NSC) 处于静止或动态平衡状态，在疾病或某些生长因子的刺激下能被诱导、活化，以替代疾病中缺乏的神经细胞。在正常成年个体，内源性NSC主要存在于室管膜下区、纹状体、海马、嗅球等部位。随着研究深入，人们发现NSC在大脑皮层也有少量存在〔1〕。在前期研究中，笔者发现针刺可诱导黑质致密部内源性脑源性神经营养因子和NSC标记物nestin的表达〔2，3〕，促进NSC的增殖、分化；艾灸也可促进学习记忆减退老年大鼠海马神经发生〔4〕。本文以快速老化小鼠（SAMP8）为对象研究针灸干预对皮层NSC增殖分化的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 SAMP8 18只，正常老化小鼠（SAMR1）6只，均为雄性，8月龄，体重20～24 g，由天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心提供，合格证号：WJ津实动质M准字第006号。适应性饲养1 w，动物房温度、湿度分别维持在26℃、70%左右。独立送回风净化笼具（IVC，苏杭实验动物设备厂，MAGNEAELIC）单笼饲养。

　　1.2 主要试剂 5′溴2′脱氧尿苷（5bromo2deoxyuridine，BrdU，Sigma，B5002)；羊抗BrdU多抗(abcam，ab2284)；兔抗巢蛋白(Nestin)多抗(Santa Cruz，sc7846)；兔抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Santa Cruz，sc9065)；兔抗S100 β蛋白抗体(Santa Cruz，sc28533)；兔抗β微管蛋白(βtubulinⅢ)抗体(abcam，ab18207)；兔抗半乳糖神经鞘氨醇酶(GALC)抗体(Santa Cruz，sc67352)；兔抗微管相关蛋白(MAP2)抗体(Santa Cruz，sc20172)；荧光(TRITC)标记驴抗兔IgG(SBA，USA，615003)；荧光(FITC)标记驴抗兔IgG(SBA，644002)。

　　1.3 主要仪器 华佗牌针灸针：苏州医疗用品厂有限公司，0.19×10 mm，批号200704；艾绒：苏州医疗用品厂有限公司，批号2000801；冰冻切片机：德国Leica，型号CM1100；显微镜：德国Leica，DM4000B；荧光显微装置：德国Leica，DMI RE2；数码相机输出系统：德国Leica DFC 480；图像采集及分析系统：Leica Qwin v3。

　　1.4 动物分组 采用计算机完全随机的方法，将SAMP8小鼠随机分为快速老化组（模型组），针刺治疗组（针刺组），艾灸治疗组（艾灸组）；SAMR1小鼠为正常老化组（对照组）。

　　1.5 治疗方法 针刺组：参照文献，选取督脉之“百会”〔5〕，于小鼠头顶两耳根连线中点(顶骨正中)取穴，操作者左手固定小鼠，右手持针灸针进行针刺，向前平刺约2 mm，进针之后，行捻转手法操作约10 s，频率约150次／min，然后放进笼具里，自由活动，每隔5 min行针1次，治疗20 min。每天治疗1次，7次为1个疗程。每个疗程结束后，休息2 d，再进入下1个疗程，共治疗3个疗程。艾灸组：“麦粒灸”选穴同针刺组。操作者左手固定小鼠，右手持眼科剪剪去穴位区皮毛。先用艾绒制备麦粒大小的艾炷，治疗时操作者左手固定小鼠，在穴位上涂抹凡士林，然后右手用镊子持一粒艾炷，放在穴位上，用线香点燃艾炷，勿吹，待其自然熄灭后，再燃另一炷，共燃3炷。每天治疗1次，疗程同针刺组。对照组和模型组：除不予针刺或者艾灸治疗外，每天在相同的时间，给予与针刺组相同方式的抓取，每次抓取约10 s，每隔5 min抓取1次。

　　1.6 BrdU注射标记 在动物处死前1 w，给予小鼠腹腔注射BrdU，50 mg/kg，每天1次，连续注射7 d。

　　1.7 取材 在第7次BrdU腹腔注射后的第2天，心脏灌注固定后取出大脑，入4%多聚甲醛后固定，梯度蔗糖沉淀。分离出皮层行冰冻切片，切片厚8 μm。

　　1.8 指标检测 采用免疫荧光双标法。其中BrdU/Nestin双标检测NSC增殖；BrdU/MAP2、BrdU/βtublin Ⅲ双标检测NSC向成熟神经元、未成熟神经元分化；BrdU/GFAP、BrdU/S100 β、BrdU/GalC双标检测NSC向成熟星形胶质细胞、未成熟星形胶质细胞、少突胶质细胞分化。荧光显微镜下给予荧光激发，激发波长为：FITC515～565 nm，RPE570 nm，TRITC580 nm；吸收波长：FITC490～495 nm，RPE550 nm，TRITC610 nm。通过ImageproPlus软件6.0完成图像分析。

　　1.9 统计学处理 数据用x±s表示，采用SPSS15.0统计软件进行单因素方差分析、Q检验(One WayANOVA)。

　　2 结果
　　
　　2.1 各组小鼠皮层NSC增殖结果 见图1。各组皮层都有BrdU/Nestin表达阳性细胞。其中，与对照组（27.98±4.22）比较，模型组（13.23±6.62）、针刺组（21.08±5.67）、艾灸组（20.51±6.32）阳性细胞数减少（P＜0.01，P＜0.05）；但模型组与针刺组、艾灸组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

　　a对照组；b模型组；c针刺组；d艾灸组；下图同。第1行，Nestin标记；第2行，BrdU标记；第3行，BrdU/Nestin标记

　　图1 BrdU/Nestin荧光双标结果（×400）（略）

　　2.2 各组小鼠皮层NSC向神经元分化结果 见表1、图2。结果显示，对照组小鼠皮层NSC均可向成熟神经元和未成熟神经元分化；模型组小鼠皮层NSC向成熟神经元和未成熟神经元分化数目均少于对照组（P＜0.01，P＜0.05）；针刺组小鼠皮层NSC向成熟神经元和未成熟神经元分化数目均多于模型组（P＜0.05），而艾灸组小鼠皮层NSC向成熟神经元分化的数目与模型组之间的差异无统计学意义（P>0.05），向未成熟神经元分化数目多于模型组（P＜0.05）。

　　表1 BrdU/MAP2、BrdU/βtublin Ⅲ荧光双标阳性细胞数比较（略）

　　与对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较：3）P＜0.05，4）P＜0.01；表2同

　　A图：BrdU/MAP2标记，第1行MAP2；第2行BrdU；第3行BrdU/MAP2；B图：BrdU/Tublin标记，第1行Tublin；第2行BrdU；第3行BrdU/Tublin

　　图2 BrdU/MAP2、BrdU/Tublin免疫荧光双标结果(×400)（略）

　　2.3 各组小鼠皮层NSC向胶质细胞分化结果 见表2、图3。结果显示，对照组小鼠皮层NSC均可向成熟星形胶质细胞、未成熟星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。模型组皮层NSC向成熟星形胶质细胞、未成熟星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的数目均多于对照组（P＜0.01，P＜0.05）；针刺组皮层NSC向成熟星形胶质细胞、未成熟星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的数目均少于模型组（P＜0.01，P＜0.05）；而艾灸组皮层NSC向成熟星形胶质细胞、少突胶质细胞分化数目少于模型组（P＜0.01，P＜0.05），但向未成熟星形胶质细胞分化的数目与模型组的差异无统计学意义(P＞0.05)。

　　A图：BrdU/GFAP标记，第1行GFAP，第2行BrdU，第3行BrdU/GFAP；B图：BrdU/S100 β标记，第1行S100 β，第2行BrdU，第3行BrdU/Tublin；C图：BrdU/Galc标记，第1行Galc，第2行BrdU，第3行BrdU/Galc
　　
　　图3 BrdU/GFAP、BrdU/S100 β、BrdU/Galc免疫荧光双标结果(×400)（略）

　　表2 BrdU/GFAP免疫荧光双标阳性细胞数比较（略）

　　3 讨论
　　
　　近年来运用针刺或艾灸调节或者诱导内源性NSC增殖分化或神经发生的研究日益增多。目前对成年哺乳类动物脑中内源性NSC研究比较多的部位主要集中在嗅球(OB)、侧脑室室下区(SVZ)、海马齿状回(DG)的颗粒下层(SGZ)等部位。然而研究发现，大脑皮层也有少量存在，Magavi等〔1〕发现成年大鼠新皮质第四层神经元在凋亡性损伤后，内源性NSC可在原位被诱导分化为层状和区域特异性神经元，且有靶向性轴突投射的建立。
　　
　　本研究发现各组均有增殖现象，提示无论是正常老年生理状况还是病理（快速老化）均存在NSC增殖。SAMP8小鼠NSC阳性细胞数少于SAMR1，提示病理状态下皮层NSC的增殖能力下降。针刺、艾灸组与模型组的增殖现象没有统计学差异，这与其他实验报道不一致〔6，7〕。笔者认为，可能与取材时间有关。本组是在针刺或者艾灸治疗3个疗程（即治疗21 d）后进行NSC增殖、分化的检测，增殖没有差异，可能针刺、艾灸在取材的这一时间点主要影响NSC的分化。本研究结果显示，各组小鼠均有皮层NSC分化现象，提示在老年期，无论是生理状态还是病理状态都持续存在着NSC分化，这和众多相关报道一致〔8～10〕，也与笔者前期实验相一致〔4〕。针刺和艾灸在促进NSC分化方向上存在着差异性。针刺可促进向神经元（成熟神经元、未成熟神经元）分化，抑制向胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞）分化；艾灸主要是促进向未成熟神经元分化、抑制向成熟胶质细胞和少突胶质细胞分化。笔者认为这可能与针刺和艾灸的作用效应途径不同有关，针刺对机体产生的是机械力学刺激，艾灸对机体产生的温热刺激，并分别通过痛觉通路、温度觉通路向上传导至中枢产生作用。这可能提示针刺、艾灸作为两种不同的刺激方式，均能促进NSC分化，但因有不同的刺激方式和作用效应途径促进NSC向不同方向分化。

参考文献

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