阿胶对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化功能的影响

【摘要】 目的 观察阿胶含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化功能的影响。方法 应用MTT法观察阿胶对体外培养成骨细胞增殖功能的影响，ELISA法观察阿胶对体外培养成骨细胞ALP含量的影响。结果 三个剂量组的阿胶含药血清对体外培养大鼠成骨细胞的增殖无促进作用，但对体外培养大鼠成骨细胞内ALP的合成有明显的促进作用。结论 阿胶对体外培养大鼠成骨细胞的增殖无促进作用，但能促进体外培养大鼠成骨细胞的分化功能。

【关键词】 阿胶；成骨细胞；细胞培养

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of the medicinecontaining blood serum of Ejiao on the multiplicative and differentiative function of the osteoblast of wistar rats cultured in vitro.Methods MTT method was used to observe the effect of Ejiao on the multiplicative function of the osteoblast and ELISA metod was adopted to observe the effect of Ejiao on ALP content of the osteoblast.Results The medicinecontaining blood serum of the three dosage groups of Ejiao had no promotive effect on the multiplicative function of osteoblast， but it had obvious promotive effect on the ALP synthesis inside the osteoblast.Conclusions Ejiao has no promotive effect on the multiplicative function of the osteoblast， but has differentiative function on the osteoblast of wistar rats cultured in vitro.

　　【Key words】Chinese medicine; Osteoblast; Cell culture

　　现代药理研究表明，阿胶（Colla Corii Asini）对血液、造血系统，钙代谢，免疫系统及肿瘤均有明显作用〔1～3〕，且有增强记忆、抗疲劳、耐缺氧等作用〔4，5〕。近年来，有学者开始关注阿胶对骨折愈合的作用，采用原位杂交方法，探讨了阿胶对骨折愈合过程中相关基因表达的影响〔6〕，结果表明，阿胶可加强巨核细胞的聚集及增强其活性，并可促进软骨细胞、成骨细胞的增殖及合成活性，加快软骨内骨化，促进骨愈合。目前，采用血清药理学方法和成骨细胞体外培养技术，观察阿胶对大鼠成骨细胞增殖、分化功能影响的研究尚鲜见报道。本研究采用血清药理学方法及成骨细胞体外培养技术，观察中药阿胶对大鼠成骨细胞增殖、分化功能的影响，为探讨阿胶在骨折愈合过程中对成骨细胞的调控作用提供理论和实验依据，也为阿胶在骨伤科临床的运用提供一些资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 大鼠成骨细胞的分离培养

　　取1日龄Wistar大鼠乳鼠20只，75%酒精浸泡15 min，揭去头皮，无菌条件下取出颅盖骨，剔除附着的结缔组织，PBS液清洗3次，将其置入含有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，加入0.25%胰蛋白酶5 ml，置入孵箱中消化30 min，血清终止消化，吸去上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶5 ml，置于孵箱中消化1 h，冷PBS终止消化，吸取上清液，1 000 r/min离心10 min，使细胞沉淀，用PBS冲洗细胞2次，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，24 h后换液，以后隔日换液1次。培养至第4～7天，细胞长成致密单层，铺满培养瓶底，进行传代。弃去原培养液，用DHank′s液冲洗2次，每瓶加入0.25%胰蛋白酶消化，相差显微镜下观察细胞，约4 min细胞成圆形，1 000 r/min离心10 min，弃去消化液，再用DHank′s液冲洗1次，加入培养液，制成细胞悬液，以1×106密度种植于25 ml一次性培养瓶中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下继续培养。

　　1.2 药物与分组

　　1.2.1 阿胶含药血清的制备

　　健康Wistar大鼠40只，体重(280±20) g，雌雄各半随机分为4组，空白血清对照组，阿胶低剂量组，阿胶中剂量组，阿胶高剂量组。给药方法：按人鼠体表面积法换算，以成人临床等效剂量的7倍为低剂量组（1 g/kg），低剂量组的2倍为中剂量组（2g/kg），低剂量组的4倍为高剂量组（4 g/kg），每日给药2次，连续给药3 d；空白血清对照组灌胃生理盐水。此期间各组环境相同，自由饮水、摄食，保持自然光照。末次给药后1 h，无菌操作下腹主动脉取血，离心25 min，3 000 r/min，每组血清混匀（有溶血的剔除），56℃水浴，30 min灭活，经0.45 μm滤膜抽滤除菌，-20℃保存备用。用时以无血清DMEM稀释为10%浓度的含药血清。

　　1.2.2 成骨细胞分组

　　空白血清对照组，细胞模型对照组，阿胶含药血清低剂量组，阿胶含药血清中剂量组，阿胶含药血清高剂量组。

　　1.2.3 培养细胞的形态学观察

　　倒置显微镜每日观察细胞的生长情况及形态特征。

　　1.2.4 增殖情况检测(MTT法)〔7〕

　　将单细胞悬液，以每孔104个细胞密度接种于96孔培养板中，同样条件继续培养24 h。加入高、中、低三个剂量的阿胶含药血清及空白血清，每组均设7个复孔。37℃，5%CO2及饱和湿度条件下继续培养48 h后，加入MTT每孔20 μl，继续培养4 h，终止培养，小心弃去孔内上清液，加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶充分溶解。酶标仪490 nm处测定各孔OD值（用只含培养液的空白孔调零）。

　　1.2.5 碱性磷酸酶（ALP）检测(ELISA法)

　　1.2.5.1 上清制备

　　取大鼠成骨细胞以4×103的密度种植于24孔板中，继续用10%小牛血清的DMEM培养基培养24 h。吸弃上清液加入10%血清的各条件液进行培养，48 h后吸取上清放入Eppdorf管中放入-70℃冰箱中备用。

　　1.2.5.2 检测方法

　　（1）包被微孔板：将100 μl溶于碳酸盐缓冲液（0.06 mol／L碳酸盐，pH9.6）中的条件培养基加入到微孔板孔中，在4℃孵育过夜。倾弃包被液，PBST洗3 min×3。（2）封闭：在微孔板中每孔加入150 μl封闭液（含有2％小牛血清PBS），37℃孵育1.5 h后，PBST洗3 min×3。（3）加入第一抗体：每孔中加入100 μl适当稀释的第一抗体(兔抗大鼠多克隆ALP抗体1∶1 000），37℃孵育2 h，PBST洗3 min×3。（4）加入第二抗体：每孔中加入100 μl 1∶1 000稀释的过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体，37℃孵育1.5 h，PBST洗3 min×3。（5）加入酶的底物：每孔中加入100 μl DAB显色液（6 mg DAB溶于10 ml 0.01 mol/L的TrisCl pH7.6，过滤去除沉渣，加10 μl h3O2）轻摇15 min，加入 50 μl 2 mol/L h3SO4终止液使反应停止。（6）结果测定：酶标仪测量每孔的OD值（波长490 nm）。

　　1.3 统计学方法

　　实验数据用x±s表示，数据处理采用SPSS11.0版本进行，两组间均数比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 培养细胞的形态观察

　　倒置相差显微镜观察：细胞在接种后24 h左右可见大部分细胞贴壁、伸展，呈纺锤形、梭形、多角形，胞浆丰富向外伸展，单核，核大而清晰，呈圆形或卵圆形，含1～2个核仁。随着培养时间的延长，细胞伸出较多的突起，有的突起相互连接。培养3～5 d后，细胞融合为单层，多呈长梭形，也有多角形。局部有细胞密集的细胞团，符合成骨细胞的特点。经传代后，形态与原代细胞无明显差异。

　　2.2 阿胶对大鼠成骨细胞增殖功能的影响

　　见表1。结果提示，三个剂量组的阿胶含药血清对成骨细胞增殖的促进作用与空白血清对照组比较无显著性差异（P＞0.05），与细胞模型对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。

　　2.3 阿胶对大鼠成骨细胞内ALP的影响

　　见表1。结果提示，低、中剂量组的阿胶含药血清对成骨细胞内ALP的作用与空白血清对照组比较有极显著性差异（P＜0.01），高剂量组的阿胶含药血清对成骨细胞内ALP的作用与空白血清对照组比较有显著性差异（P＜0.05），三个剂量组的阿胶含药血清对成骨细胞内ALP的作用与细胞模型对照组比较有极显著性差异（P＜0.01）。表1 各组成骨细胞MTT、ALP测定值(略)

　　3 讨 论
　　
　　成骨细胞是骨形成细胞，是骨形成和代谢的核心部分，对骨组织的生长发育和骨损伤的修复起关键作用。体外培养成骨细胞是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。许多实验证实，体外培养的成骨细胞具有与体内成骨细胞相同的生物学特性，能很好地反映成骨细胞的功能活动特点，为采用体外成骨细胞培养技术进一步深入研究骨发生、生长机制，及中药对其干预作用提供了理论基础。骨折愈合过程是个复杂的过程，受诸多因素的影响，如何加速骨折愈合，一直是骨伤科领域研究的重要课题。近年来在细胞水平研究中药促进骨折愈合的报道日益增多，利用体外成骨细胞培养技术来研究探讨接骨中药的疗效作用机制已经取得了一定的成果。李秋静等〔8〕观察接骨药对人成骨细胞增殖的影响，结果显示，接骨药不但能促进成骨细胞的增殖，而且与浓度、作用时间呈正相关。冯伟等〔9〕比较常用单味接骨中药对体外培养成骨细胞的作用，结果显示除当归外均无明显促增殖和分化作用，当归、自然铜能增加速成骨细胞矿化期矿化结节的形成。
　　
　　阿胶的药理作用主要为补血、抗休克、改善钙代谢平衡、调节免疫功能、止血、促进淋巴细胞转化率等〔10〕，本研究显示，阿胶对体外培养成骨细胞的增殖虽无明显作用但对ALP有明显的促进作用。目前认为，ALP是成骨细胞分化的早期指标，其作用是水解有机磷酸释放出无机磷，用于羟基磷灰石的形成，因此是骨形成的特异性酶。实验中不同浓度的阿胶含药血清能提高成骨细胞中ALP的含量，说明阿胶含药血清能促进成骨细胞的分化成熟，因而可提高成骨细胞的骨形成功能，有助于加速骨折愈合过程。但本实验的结果是阿胶含药血清对体外培养的大鼠成骨细胞的直接作用，至于在人体内的作用如何还有待于进一步探讨。

参考文献

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　　2 熊元君，武嘉林，季新梅，等. 阿胶口服液的主要药效学研究〔J〕. 中草药，1999；30（7）：520.

　　3 刘培民，蔡宝昌，尤金花，等. 复方阿胶浆对荷Lewis肺癌的抑瘤作用研究〔J〕. 中药药理临床，2005；21（5）：44.

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　　7 孙为民，王慧琴.细胞因子研究方法学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2000：657.

　　　8 李秋静，崔英先，王宇健，等.接骨药对体外培养成骨细胞增殖影响的研究〔J〕.中医药学刊，2001；19:4023.

　　9 冯伟，傅文彧，朱雅萍，等.接骨中药对培养成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响〔J〕.浙江中医学院学报，2003；28（2）:657.

　　10 杜中惠，宋 健，刘东升. 阿胶现代研究与应用〔J〕. 时珍国医国药，1999；10（4）：297.