BMSCs的分离培养、纯化与鉴定

　　　　　　 作者：马民 吕志刚 杜以宽 张桂娟 马义

【摘要】 目的 建立一种持续、稳定的可多向分化的骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养体系。方法 运用密度梯度离心法从1月龄新西兰兔骨髓中分离培养BMSCs，利用相差显微镜观察其形态及生长情况，扫描电镜观察其细胞结构，运用流式细胞术分析分离细胞群所处细胞周期和细胞活力，用MTT比色法绘制细胞生长曲线，并用特定诱导液将分离的BMSCs向成骨细胞和成脂肪细胞定向诱导分化，利用ALP和油红O进行染色鉴定。结果 所分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征，分离培养的BMSCs细胞在第3天进入对数生长期，第10天进入平台期；在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨、成脂肪表型特征，可进一步定向分化，结论 所收获的细胞具有BMSCs的特异性。

【关键词】 骨髓间充质干细胞；分离；成骨分化；成脂分化

　　【Abstract】 Objective To establish a sustained and stable bone marrowderived mesenchymal stem cells (BMSCs) isolation and culture system which could be pluripotential in vitro. Methods BMSCs were isolated and cultured from the 1monthold New Zealand white rabbits through densitygradient centrifugation. Growth and ultromicrostructure of the BMSCs were observed by lightmicroscope and scan electronmicroscope. The cell activities and cell cycle were observed by flow cytometry. The grow curve of the BMSCs was described through MTT assay. BMSCs were induced and differentiate into osteoblasts and adipocytes by specific induction culture medium. Then the cells were stained with alkaline phosphatase (ALP) and Oil red O ， and analyzed the result of all staining. Results The isolated BMSCs cells were in line with the characteristics of BMSCs in morphology and growth kinetics， and the isolated BMSCs cells would be into the logarithmic growth phase in the third day and into the platform phase in the tenth day. Conclusions In the osteogenic and adipogenicinduced culture conditions， BMSCs have appeared the phenotypic characteristics of osteogenic and adipogenic respectively， and could be further directed differentiation. These indicated the harvested cells possessed BMSCs specificity.
　　
　　【Key words】 Bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs); Isolation; Osteogenic differentiation; Adipogenic differentiation

　　软骨组织工程技术〔自体软骨细胞的移植、生长因子对软骨细胞的作用、骨髓间充质干细胞（又称骨髓基质干细胞，BMSCs）在软骨组织工程中的作用、转基因技术〕是当今的研究热点〔1，2〕。特别是自体BMSCs，因其低免疫原性、无限扩增性及多向分化潜能等诸多优点而引起广泛关注，成为软骨组织工程种子细胞的首选来源。本实验选择合适的BMSCs体外分离、纯化和扩增方法，并通过形态学观察（光镜、电镜）、细胞周期（流式细胞仪）、多细胞系（成骨细胞，脂肪细胞）分化能力对其进行鉴定，以期建立一种较理想的BMSCs培养体系，为BMSCs的临床应用提供理论依据和技术方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1月龄健康新西兰兔，雌雄不限，由广东省动物实验中心提供（合格证号：2006A024）。Percoll 细胞分离液购自Pharmacia公司；4羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和胰酶购自Amersco公司；噻唑兰（MTT），二甲基亚枫（DMSO），抗坏血酸(AA)，吲哚美辛，胰岛素，台盼蓝，3异丁基1甲基黄嘌呤（IBMX）均购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 BMSCs的分离与培养

　　利用密度梯度离心法分离BMSCs细胞：取1月龄健康新西兰兔麻醉成功后，备皮，用75%酒精、3%碘酒消毒大鼠双侧下肢，铺无菌洞巾；无菌条件下用20 ml注射器迅速穿刺抽取双侧髂棘骨髓5 ml；在超净台内用无菌5 ml注射器抽取等量不含FBS的LGDMEM培养液，重悬细胞，装入螺口离心管中，800 r/min离心6 min，弃上清液，以祛除脂肪和骨膜等组织细胞，用含有10%FBS的完全细胞培养液重悬细胞；以1∶1体积比沿壁缓慢注入至含10 ml淋巴分离液的离心管内，1 500 r/min离心30 min，吸取液面交界处环状淡黄色单核细胞云雾层；完全细胞培养液重悬细胞，反复吹打均匀，制成单细胞悬液，在光学显微镜下用血球计数板计数，以2×105/ml密度接种于25 cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5% CO2，饱和湿度的恒温培养箱中；24～48 h后在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况。多数细胞贴壁生长且轻微摇晃瓶身见细胞不易脱落后，在超净台内首次半量换液（每次换液都加入含10%FBS的完全培养液），弃去未贴壁细胞，以后每2～3 d全量换液1次。

　　1.2.2 传代

　　原代培养约12～14 d左右，细胞已贴满培养瓶，呈成纤维细胞样，接近融合生长。用0.25%胰酶+0.02%EDTA 37℃消化原代细胞约3～5 min，光学显微镜下见贴壁细胞挛缩变圆后，加入含有新鲜FBS的培养液终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液，按1∶2比例传代，接种于两个培养瓶中，以后每8 d按1∶3比例传代培养。每次换液弃去未贴壁细胞，以纯化BMSCs。

　　1.2.3 台盼蓝染色法检测细胞活性

　　取4份0.2％台盼蓝与l份4.25％NaCl混合，再用l份台盼蓝盐水溶液加到1份细胞悬液中(1∶2稀释)，然后滴加到计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞)及染色的细胞数(死细胞)。用台盼蓝染细胞时，活细胞拒染，死细胞可摄取染料。台盼蓝染色后3 min之内计数完毕，以加强计数的准确性。

　　1.2.4 BMSCs的鉴定

　　1.2.4.1 BMSCs的形态学观察

　　自原代培养开始动态观察BMSCs的生长情况。取生长状态良好的P3代BMSCs，经0.25%胰酶+0.02%EDTA消化后，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于预先置有盖玻片的6孔板中，将接种好的培养板放入37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱内培养。每天观察细胞生长情况，取出细胞生长良好且细胞密度适中的细胞玻璃爬片，用4℃预冷的2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液固定1～2 h，0.1 mol/L的PBS冲洗3次，每次5 min；分别用50%、70%、90%的乙醇梯度脱水5 min；100%乙醇脱水3次，每次5 min；再用醋酸异戊酯处理3次，每次5 min；用CPD030型临界点干燥器行二氧化碳临界点干燥后将样本固定在铜台上，离子溅射仪金靶喷膜，厚度为510 nm，在扫描电子显微镜下观察并摄像。

　　1.2.4.2 BMSCs的细胞周期分析

　　取生长良好的第3代BMSCs用PBS洗3次，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后制成细胞悬液，收集大约细胞2×106个，缓慢滴加到4℃预冷的70%冰乙醇固定24 h。离心去除乙醇，0.1 mol/L PBS洗涤细胞2次，将细胞悬浮于0.5 ml PBS中，加入10 mg/ml RNaseA 10 μl，37℃水浴孵育30 min后，离心去上清；加入5 mg/L的碘化丙啶，40℃避光染色30 min，用流式细胞仪488 nm检测并分析结果。

　　1.2.4.3 MTT法测定BMSCs的生长曲线

　　取生长状态良好的第3代BMSCs经0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，制备成单细胞悬液，以2×103/ml接种于7个96孔板，每个孔中的体积分别100 μl。从接种后的第1天起进行MTT测定，前3 d每天测1板，以后每隔1 d测量1板。弃去培养液，DHanks液冲洗3次，更换无血清的DMEM培养基90 μl，同时加入5 mg/ml的MTT 10 μl/孔，置37℃，5%CO2 培养箱中孵育4 h后，弃去上清液，加入DMSO 150 μl/孔，微孔板振荡器振荡10 min，在酶标仪上测OD值。测量波长为570 nm，参比波长655 nm，以未接种细胞的孔作为调零孔。记录结果，以时间为横轴，OD值为纵轴，绘制生长曲线。

　　1.2.4.4 多向诱导分化

　　1.2.4.4.1 成骨诱导及鉴定

　　将培养第3代生长良好的BMSCs按2×104/ml密度接种培养于预先置有小盖玻片的6孔板中，待细胞达到80%～90%融合后，加入成骨诱导液，每3 d换液1次，倒置显微镜下观察。诱导15 d后取出爬有细胞的盖玻片，PBS冲洗数次，冷丙酮固定10 min，蒸馏水冲洗数次，浸入β甘油磷酸钠孵育液，37℃孵育6 h；蒸馏水洗后，用2%硝酸钴中浸3～5 min，蒸馏水洗后，再用1%硫化铵中浸2 min，洗后自然干燥，树胶封固，置普通光镜下观察。

　　1.2.4.4.2 脂肪细胞诱导及鉴定

　　将培养第3代的BMSCs按2×104/ml密度接种培养于预先置有小盖玻片的6孔板中，待细胞达到80%～90%融合后，加入脂肪细胞诱导液，每3 d换液1次，倒置显微镜下观察。诱导15 d后取出爬有细胞的盖玻片，用PBS清洗数次，室温下10%福尔马林固定10 min，饱和油红O染液孵育1 h；60%异丙醇洗去多余染液，蒸馏水清洗2 min，1%盐酸分化2 s，蒸馏水清洗10 min，脱水透明，中性树胶封固，置普通光镜下观察。

　　1.3 统计学方法

　　采用统计学软件SPSS13.0，计量资料数据以x±s表示。用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐，组间比较用完全随机设计的单因素方差分析;若方差不齐，组间比较用秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 分离的BMSCs的P0～P3代细胞的形态学观察

　　用倒置相差显微镜观察原代分离出的BMSCs呈圆形，胞体透亮，折光性强，大小不一；不能辨认细胞核，细胞与周围的红细胞等血系细胞相互混杂。 培养12 h时少数细胞开始贴壁，36 h首次换液后可见有大量贴壁细胞。初期呈短棒状，其后逐渐变成短梭形，呈成纤维细胞外观，彼此不相接触，有细胞突起，细胞核较大，扁圆形，偶见细胞分裂像。第3～5天开始出现典型的BMSCs集落样生长，大小不一。以后数量逐渐增多，集落中心周围有放射状生长的贴壁细胞，胞体略大，形态均一，多呈梭形，排列紧密；之后细胞增殖迅速，集落相互合成片。12～14 d集落中心细胞密集，细胞逐渐融合成单层。此时细胞间相互紧密贴附生长，细胞沿胞体长轴有序排列，呈旋涡状。在此期间，悬浮的杂细胞（如红细胞和白细胞）随换液而被逐渐弃除。传代细胞接种后1～2 h开始迅速贴壁，伸展，重新恢复成梭形；24 h基本完成贴壁，细胞呈均匀生长，细胞形态更加单一；8～10 d铺满瓶底（图1）。

　　用扫描电镜观察培养的BMSCs的P3代细胞，为长梭或长的多角形，较为粗大；细胞表面粗糙，有较多突起和细长的微棘和丝突，并且存在许多颗粒物质。细胞表面可见多量的圆泡和片足，表明细胞贴壁良好，活力强；细胞周围还可见薄纱样基质成分存在，且细胞之间孔隙较多，大小不一，孔隙间多有交通，多个细胞存在时细长的丝突互相搭连在一起，形成类似的网状结构（图2）。

　　2.2 分离的BMSCs P3代细胞细胞周期检测

　　流式细胞仪显示，第3代BMSCs中G0/G1期细胞为82.73%，G2期细胞为8.25%，S期细胞为9.03%，大部分细胞处于静止期，只有极少数的细胞处于活跃的增殖期，符合干细胞特征（图3）。

　　2.3 BMSCs的细胞生长曲线

　　MTT法测定BMSCs的生长曲线呈S形，传代后第1、2天，吸光值变化不大，为细胞的潜伏适应期；第3天起细胞大量增加，进入对数生长期；第5～9天达到顶点；至第10天细胞数量开始稳定在相对稳定的水平，表明细胞生长进入平台期（图4）。

　　2.4 BMSCs的多向诱导分化

　　2.4.1 成骨诱导

　　骨向诱导后的BMSCs第6天后形态开始发生变化，由梭形逐渐转化为方形、鳞片形、三角形或多角形等；第8天时，细胞外基质分泌增多，胞浆中及胞质外均可见较多细小黑色颗粒，胞核颜色较淡，胞浆色变深；第21天时，细胞聚集成多个散在的细胞结节，结节中间的细胞由梭形变为矮立方形或锥体形，排列紧密，逐渐形成多层结构，并产生大量分泌颗粒，将结节包埋，结节中心部逐渐变浓，直至不透光而形成黑色的致密团状结构（图5A）。经钙钴法染色检测细胞内ALP活性，呈阳性反应，胞浆内呈现深棕色或深黑色颗粒状或大片状黑色沉淀，胞核未着色，呈空腔状，清晰可见，随机计数200个细胞，阳性率为90.5%（图5B）。

　　2.4.2 成脂诱导

　　脂肪向诱导后的BMSCs逐渐变为圆形、椭圆形。第5天起光镜下可见胞浆内出现黄色的折光性强的圆形的小脂滴，小脂滴逐渐增多，融合成大脂肪滴，细胞核被脂滴挤于一侧（图6A）。油红O染色示脂滴呈红色。随着诱导时间的延长，脂肪细胞的比例逐渐增高，逐渐成长为成熟脂肪细胞，偶有大脂滴破裂现象（图6B）。

　　3 讨论
　　
　　BMSCs是存在于骨髓的一类多能干细胞，主要包含成纤维样间质干细胞、小的非粒性细胞（循环干细胞，RS1）、小的粒性细胞（RS2）以及内皮细胞、部分造血干细胞等多种细胞成分。有研究表明BMSCs增殖能力与RS1密切相关，即RS1细胞的存在与否对维持BMSCs的增殖能力有着非常重要的作用，而BMSCs分泌的各种细胞因子又调节着RS1细胞的循环，故有研究认为RS1细胞实质上就是进入循环的非定向的BMSCs〔3〕。体外培养的BMSCs体积小，成梭形或多角型，核浆比大，多呈平行排列生长或漩涡状生长。在细胞生长的对数期，BMSCs的倍增时间约为30 h。BMSCs不表达分化相关的细胞标志，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及ALP或BGP和造血系标志等〔4〕。自Friedenstein等从大鼠的骨髓中分离培养出BMSCs，发现因其具有增殖传代能力强、细胞均一性好、能够多向分化等特点〔5〕，BMSCs在创伤缺损和退行性变后修复、组织工程种子细胞等领域受到越来越多重视。
　　
　　BMSCs在骨髓中的含量很少约为0.001‰～0.01‰，在骨髓的有核细胞中所占比例约为1/10万，仅为200个/ml〔6〕，其数量和生长能力与年龄呈显著的负相关。因此要利用BMSCs就要实现其分离纯化和体外扩增。目前用于分离BMSCs的方法主要有4种：全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。较为常用的是全骨髓贴壁法和密度梯度离心法。后两种方法是通过免疫学的技术分离BMSCs，分离细胞的纯度高，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记；而且两者的分离操作对细胞活性都有较大影响，造成BMSCs损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法应用〔7〕。本研究利用密度梯度离心法收获骨髓中BMSCs，获得的BMSCs细胞形态较一致，纯度相对较高，但细胞首次融合的时间会稍长（17 d），这可能是因为细胞生长所需要的某些因子来自与其伴生的其他细胞，此方法可最大限度除去骨髓中的造血细胞，获得较纯的骨髓内单核细胞，且传代后克隆时间短，便于观察和记录细胞的生长状态〔3〕。
　　
　　BMSCs传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的端粒酶活性。在体外特定的诱导条件下BMSCs可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。由于目前没有筛选到BMSCs特异性的表面标志，所以本研究通过对BMSCs的形态学观察、细胞周期分析、多向分化能力的鉴定证明体外分离培养的细胞为BMSCs。 利用扫描电镜观察体外分离培养的第3代细胞表现为长梭或长的多角形，较为粗大；细胞表面粗糙，有较多突起和细长的微棘和丝突，并且存在许多颗粒物质，且细胞之间孔隙较多，孔隙间多有交通，多个细胞间形成网状结构，从而利于贴壁生长和信号传递，细胞活性高，生长相对较快。哺乳动物多以不对称的方式进行自我更新，干细胞在增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞阶段〔8〕。基于这一特性，本研究对分离的BMSCs行细胞周期检测，结果显示， 82.73%的细胞处于G0/G1期，G2期的细胞为8.25%，S期的细胞为9.03%，表明绝大多数细胞处于相对不活跃的静止期，这与BMSCs的基本特符。而高比例的G0/G1期细胞提示BMSCs细胞具有高度的分化潜能。诱导BMSCs向成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等多种细胞分化，是目前鉴定BMSCs的金标准之一。本研究诱导体外分离培养的BMSCs第3代细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化，被诱导的细胞经ALP染色和油红O染色鉴定，表明均诱导成功。
　　
　　本研究分离的BMSCs细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs的特征，在成骨、成脂肪的诱导培养条件下，分别出现成骨表型、成脂肪表型特征，说明其可向这两种细胞分化，表明所收获细胞具有BMSCs的特异性，对中老年患者常见的关节软骨退化或者损伤等疾病的治疗康复有积极意义。

参考文献

　　1 Johnstone B，Yoo JU.Autologous mesenchymal progenitor cells in articular cartilage repair 〔J〕.Clin Orthop Relat Res，1999；(367Supp l):15662.

　　2 Beris AE，Lykis sas MG，Papageorgiou CD，et al.Advances in articular cartilage repair 〔J〕.Injury，2005；(36 Suppl 4):S1423.

　　3 高仰贤，江蓉星.骨性关节炎发病机制的国内研究进展〔J〕.中医正骨，2005；4（17）：55.

　　4 李宁华，张耀南，张 毅，等.国内六大行政区域六城市中老年人群膝关节骨性关节炎患病危险因素比较〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007；11(39)：7758.

　　5 中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南（2007年版）〔J〕.中华骨科杂志，2007；10（27）：793.

　　6 周建平.同种异体关节软骨移植的研究进展〔J〕.骨与关节损伤杂志，2002；17（4）：3167.

　　7 李宁华，薛庆云，张 毅，等.中国六城市中老年人群腰椎骨关节炎患病危险因素地区调查:6128名资料分析〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007；11（47）：9508.

　　8 刘向前，姚共和，卢 敏，等.膝关节骨关节炎期刊文献病机因子与证候类型分析〔J〕.江苏中医药，2005；10（26）：63.