神经酰胺对结肠癌HT29细胞凋亡和增殖细胞核抗原表达的影响

　　　　　　 作者：严兴耘 杨龙 谭维国 陈乐如 许祥裕

【摘要】 目的 探索神经酰胺（C2cer）影响人结肠癌HT29细胞增殖、凋亡和增殖细胞核抗原（PCNA）表达。方法 12.5、25 μmol/L的C2cer处理HT29细胞，用MTT法、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、Western印迹等方法检测HT29细胞增殖、凋亡和PCNA表达。结果 以12.5、25 μmol/L的C2cer处理HT29细胞，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡明显增加，PCNA表达明显降低，并呈剂量效应关系。结论 C2cer可诱导细胞凋亡，该效应可能与下调PCNA表达有关。

【关键词】 HT29 细胞；神经酰胺；增殖细胞核抗原；细胞凋亡

结肠癌是中老年人常见消化道恶性肿瘤之一，常规治疗疗效欠佳〔1〕。神经酰胺（C2cer）是细胞膜组成成分，也是一种细胞凋亡中的常见第二信使分子，它参与调控机体细胞的分化、凋亡、生长停止、细胞因子合成及分泌、免疫反应等病理生理过程〔2〕，与血液、神经、消化、生殖等系统多种肿瘤的发生、发展密切相关，它作为一种潜在的肿瘤细胞凋亡治疗剂引起了国内外学者的广泛关注〔3〕。C2cer使凋亡基因（Bax、Bad和Bid基因）表达水平增高，B细胞淋巴瘤/白血病2和xl（Bcl2和Bclxl）基因表达水平减弱，脂肪酸合成酶（Fas）蛋白的表达增加，p53蛋白的表达降低，诱导人结肠癌HT29细胞发生凋亡〔4，5〕。增殖细胞核抗原(PCNA) 是细胞周期调节蛋白，其表达的程度和含量反映细胞增殖的活性，PCNA高表达者增殖力、侵袭力、转移力均较强，肿瘤预后差〔6〕。为进一步探讨C2cer影响HT29癌细胞增殖的机制，本实验观察C2cer 对HT29结肠癌细胞的增殖、凋亡以及PCNA表达影响，为C2cer抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡这一控制肿瘤新的策略提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 HT29结肠癌细胞株由第三军医大学西南医院肿瘤科彭亦良博士惠赠。细胞常规培养、传代。取指数期细胞进行试验。C2cer为Sigma公司产品，用二甲基亚砜（DMSO）作溶剂；兔抗PCNA单克隆抗体和Cy3羊抗兔二抗，工作浓度为1∶150，Santan公司产品。免疫组化ABC试剂盒，北京中杉公司品。膜联蛋白荧光素(AnnexinVFLUOS)凋亡试剂盒，德国宝灵曼公司产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 实验分组 低浓度组：12.5 μmol/L的C2cer处理HT29细胞，高浓度组：25 μmol/L的C2cer处理HT29细胞，对照组：不含C2cer的DMSO处理组。

　　1.2.2 MTT检测 96孔板中每孔加100 μl的2×104/ml HT29细胞，预培养24 h；每孔加100 μl经二倍递减稀释的C2cer，再培养24 h，每组平行3个复孔。加50 g/L MTT试剂20 μl，培养4 h，弃上清160 μl，加200 μl DMSO，在MODEL 450酶联仪(BIORAD)上测492、630 nm双波长的OD值，绘制生长曲线。

　　1.2.3 细胞凋亡检测 按试剂盒说明书进行。取约1×106细胞，PBS洗涤后离心5 min，弃尽上清，重悬于100 μl AnnexinVFLUOS标记缓冲液(1 000 μl溶液Ⅲ中预先加入20 μl AnnexinVFLUOS单抗及20 μl 50 μg/ml PI)中，室温避光放10 min，加0.4 ml的溶液Ⅲ，上机检测。

　　1.2.4 免疫细胞化学检测PCNA表达 将多聚赖氨酸包被过的无菌盖玻片置于培养瓶内，常规培养12 h制作细胞爬片。取细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定30 min后用0.3%甲醇h3O2封闭非特异性15 min，接着用含1%血清白蛋白(BSA)、0.5%苯基醚(TritonX100)的PBS缓冲液孵育打孔20 min，然后用含5% 羊血清的PBS液孵育封闭20 min，再加1∶150的PCNA抗体，室温2 h后4℃过夜，最后经PBS冲洗后加1∶150的Cy3二抗且37℃孵育30 min，20％甘油封片，德国产Leica TCSNT型激光扫描共聚焦显微镜观察，测定细胞相对荧光强度。阴性对照实验：用PBS代替PCNA抗体孵育。

　　1.2.5 Western印迹半定量分析PCNA表达 收获处理12 h的细胞，以蛋白裂解液提取蛋白并测定蛋白含量。制备10%分离胶和5%积层胶，50 μg总蛋白上样，80 V 180 min蛋白电泳转印至聚偏氟己烯(PVD)F膜，膜用5 %脱脂奶粉37℃封闭1 h，加1∶150的PCNA抗体，1∶150 通用二抗，1∶200稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素，DAB显色。蛋白表达结果以PVDF膜上棕色染条带的深浅来判断。

　　1.3 统计学分析 所用数据用x±s表示，采用SPSS10.0进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 MTT法观察C2cer影响HT29细胞增殖效应 低于0.05 μmol/L的C2cer对HT29细胞的增殖影响不明显(P＞0.05)，3.125～6.25 μmol/L的C2cer明显减缓HT29细胞增殖，高于12.5 μmol/L的C2cer细胞导致HT29增殖几乎完全停滞，细胞死亡。见图1。

　　图1 C2cer影响HT29细胞增殖的抑制曲线（略）

　　2.2 AnnexinV/PI检测C2cer作用12 h影响HT29细胞的凋亡 AnnexinV结合PI染色，流式细胞仪把细胞分为坏死、凋亡晚期、正常和凋亡早期细胞。12.5、25.0 μmol/L的C2cer作用HT29细胞12 h后，细胞凋亡比例约为(53.64±9.11)%和(83.94±11.62)%，细胞凋亡呈剂量效应关系，表明C2cer是HT29细胞强有力的凋亡诱导剂。见表1。

　　2.3 PCNA免疫组织化学结合激光扫描共聚焦显微镜检测结果 PCNA为增殖核抗原，表达于细胞核，与细胞增殖程度相关。阳性为细胞核中表达红色荧光，对照组细胞中PCNA表达呈强阳性。对照组、低浓度组和高浓度组细胞中的PCNA表达相对荧光强度分别为(126.10±22.49)，(80.43±18.33)和(52.82±10.46)。与对照组相比，低浓度组和高浓度细胞中PCNA表达明显降低(P＜0.01)，高浓度组细胞中PCNA表达较低浓度组明显降低（P＜0.01），表明C2cer能下调HT29细胞中PCNA的表达，且呈剂量效应关系。见图2。

　　表1 C2cer处理12 h对HT29细胞凋亡的影响（略）

　　与对照组比较：1）P＜0.01；与低浓度组比较：2）P＜0.01

　　图2 免疫细胞化学检测HT29细胞PCNA表达(SP，×400) （略）

　　2.4 Western印迹检测C2cer影响HT29细胞中PCNA表达 HT29细胞中PCNA呈高表达，对照组、低浓度组、高浓度组的平均IOD分别为(1.51±0.362)、(1.05±0.225)、(0.516±0.138)，C2cer明显下调HT29细胞中PCNA的表达，呈剂量效应关系。见图3。

　　图3 Western印迹检测C2cer影响HT29细胞中PCNA表达（略）

　　3 讨论
　　
　　结肠癌早期多无症状，不易发现，同时又因其特殊的解剖部位，肿瘤易发生腹膜外转移，常规的手术、放疗和化疗等治疗效果均不太理想。因此，探寻一种新的治疗方案或治疗模式尤为重要。鞘磷脂作为一种有潜力的用于肿瘤方面的化学预防剂或治疗剂已引起了国内外学者的广泛关注〔7，8〕。鞘磷脂是各种动、植物细胞生物膜的重要组成部分，其主要成分是神经鞘磷脂(SM)，SM由鞘氨醇(SP)、脂肪酸及磷酸胆碱组成。C2cer是多种细胞功能如细胞分化、衰老、增殖和细胞循环停滞的第二信信使，激活酶级联反应和转录因子的转录活性，产生多种生物效应。许多胞外的刺激因素，如化疗药物、辐射、肿瘤坏死因子α和内毒素等引起的细胞凋亡均由C2cer将凋亡信号传递给其下游的靶分子，如激活SAPK/JNK等信号途径，引起凋亡的信号级联反应〔7〕。越来越多的研究表明，C2cer等鞘脂及其代谢物能够诱导多种肿瘤和恶性增殖细胞如腺癌、结肠癌、肝肿瘤、肺癌、鼻咽癌等的凋亡。C2cer通过影响Bcl家族基因水平的表达和Fas、p53蛋白水平表达的改变，最终促进HT29结肠癌细胞凋亡〔2～4〕。本研究结果显示，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡明显增加，并呈剂量效应关系。
　　
　　PCNA是一种与细胞周期相关的蛋白，在细胞核内合成，在G1期表达逐渐增加，S期达到高峰，G2/M期减少或消失，因此，PCNA作为细胞周期内S期的特异性标记，其出现与细胞增殖有关，其含量能反映细胞的增殖程度。PCNA是一种与DNA合成密切相关的细胞核内的酸性蛋白质，研究表明大肠癌中PCNA阳性表达率高于94.4%，与肿瘤预后较差相关〔6〕。本研究结果表明12.5、25 μmol/L的C2cer能够明显抑制HT29细胞中PCNA蛋白的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞调亡。
　　
　　总之，C2cer可抑制HT29结肠癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并明显降低HT29细胞中PCNA表达，该研究为探索结肠癌等消化道肿瘤的化学预防和化学治疗提供了一肿新的方法和新思路〔8〕。

参考文献

　　1 彭远飞，郑民华.大肠癌与细胞凋亡及诱导凋亡治疗〔J〕.上海交通大学学报（医学版），2007;27(5)：61720.

　　2 张晓峰，李百祥，任 锐.神经酰胺诱导人结肠癌细胞凋亡作用〔J〕.毒理学杂志，2006;20(2):6871.

　　3 French KJ，Schrecengost RS，Lee BD，et al.Discovery and evaluation of inhibitors of human sphingosine kinase〔J〕.Cancer Res，2003；63(18):59629.

　　4 张晓峰，李百祥，任 锐.神经酰胺诱导人结肠癌HT29细胞凋亡的研究〔J〕.卫生研究，2006;35(5): 53740.

　　5 李百祥，张 涛.神经酰胺诱导人结肠癌细胞凋亡的作用〔J〕.中国公共卫生，2004；20(5):5267.

　　6 张继红.大肠癌中p53，Ki67，PCNA的表达及与淋巴结转移的关系〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2005;6(6):5235.

　　7 Obeid LM，Linardic CM，Karolak LA，et al.Programmed cell death inducied by ceramide〔J〕.Science，1993；259（5102）:176971.

　　8 Struckhoff AP，Bittman R，Burow ME，et al.Novel ceramide analogs as potential chemotherapeutic agents in breast cancer〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2004;309(2):52332.