下肢缺血预处理对大鼠心肌基因表达的影响

　　　　 作者：张冬会 赵晓云 邢邯英 卢亚敏 庞国勋 司翠权

【摘要】 目的 通过观察经下肢缺血预处理的心肌梗死大鼠心肌中缺氧诱导因子1α（HIF1α）和血红素加氧酶1（HO1）mRNA的表达，探讨其在缺血心肌中的作用。方法 将SD雄性大鼠随机分为心肌梗死组（40只）和下肢缺血预处理组（40只）；每组按缺血时间又分为1、2、4、6、12 h组。显微镜下计数外周血白细胞；HE染色观察心肌组织中浸润白细胞的数值。应用逆转录多聚酶链反应（RTPCR）测定术后各时间点心肌组织中HIF1α和HO1mRNA表达。结果 下肢缺血预处理后12 h组外周血白细胞计数以及心肌组织中白细胞浸润数目较心梗组显著减少（P＜0.05）；心肌中1、2、4 h HIF1α mRNA表达与心梗组对应时间点比较有显著差异（P＜0.01）。各时间点HO1mRNA表达与心梗组对应时间点比较有显著差异（P＜0.01）。 结论 经下肢缺血预处理后，心肌损伤减轻，HIF1α和HO1可能与心肌保护作用有关。

【关键词】 下肢； 缺血预处理；心肌梗死

目前，心肌缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)已从心脏扩展到心外组织，如下肢、肾脏、骨骼肌等，其短暂缺血不仅能减轻局部组织或器官的缺血损伤，而且对远隔组织和器官也有保护作用，被证明是最有效的内源性心肌保护机制。Ockaili等〔1〕的研究表明，缺氧诱导因子1α（HIF1α）诱导的血红素加氧酶1（HO1）表达上调对缺血心肌有保护作用。但有关HIF1α和HO1mRNA在下肢缺血预处理中的作用机制尚未明了。本研究旨在阐述这两种基因在下肢缺血预处理对心肌梗死大鼠心肌的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 主要试剂：逆转录酶（AMVRT ）、dNTP、Taq DNA聚合酶、随机引物、琼脂糖均购自美国Promega 公司。HIF1α、HO1 及βactin 上下游引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。主要仪器：奥林帕斯显微镜（日本）；数字彩色显微图像分析系统、PCR 扩增仪(PE5700)（美国）。

　　1.2 动物分组与模型制作 选择雄性SD大鼠80只，体重250～300 g，由河北医科大学动物实验中心提供。所有大鼠实验前适应性饲养1 w，室温（25±3）℃，随机分为2组。(1) 急性心肌梗死（AMI）组：开胸并暴露大鼠心脏，结扎左冠状动脉前降支(LAD)。(2)下肢缺血预处理（LIP）组：分离双侧股动脉，动脉夹夹闭双侧股动脉5 min，开放5 min，反复4次，随后进行LAD结扎。各组均在操作结束后1、2、4、6、12 h处死大鼠。每组每个时间点8只。心脏取血计数外周血白细胞，取心尖部分提取总RNA，另取部分心肌组织固定包埋行HE染色。

　　1.3 HIF1α和HO1 mRNA表达水平的检测

　　1.3.1 总RNA提取 Trizol一步法提取组织总RNA。紫外分光光度计测RNA 的吸收度(A)值，A260/A280＞1.8认为RNA 较好无降解。采用20 μl反应体系：总RNA 2 μg，随机引物1 μl，加去离子水补至10 μl，70℃水浴5 min，迅速放冰上5 min。然后再加MMLV 1 μl，RNA酶抑制剂1 μl，4×dNTP 1 μl，5×MMLV缓冲液4 μl，37℃水浴4 h合成cDNA，所得cDNA-20℃保存。

　　1.3.2 目的基因PCR扩增 向优化体系中加入以下成分：引物1、2各5 pmol/L，cDNA 2 μl，去离子水补足20 μl。在扩增仪上进行RTPCR，PCR的反应参数：HIF1α 95℃5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，68℃ 1 min，循环35次；68℃延伸5 min。HO1为94℃ 2 min；94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，循环35次； 72℃延伸5 min。 βactin为94℃ 5 min；94℃ 35 s，56℃ 35 s，72℃ 35 s，循环35次；72℃延伸5 min。 4℃终止反应。

　　1.3.3 RTPCR产物半定量 取RTPCR产物8 μl行1.5%琼脂糖凝胶电泳，80 V，45 min，目的基因扩增产物与βactin扩增产物灰密度扫描之比作为目的基因的相对表达量。应用UVP凝胶成像分析系统分析实验结果。引物序列及扩增片段长度见表1。

　　表1 RTPCR反应引物序列及扩增片段长度（略）

　　1.4 统计学处理 实验数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，如有显著性差异，再进一步用组间两两比较q检验。

　　2 结果

　　2.1 组间外周血白细胞计数比较 LIP组心梗后12 h外周血白细胞计数明显低于AMI组（P＜0.05），其余时间点组间比较无显著性差异。见表2。

　　2.2 两组心肌组织中白细胞浸润情况 心梗后12 h LIP组心肌组织中白细胞浸润数目较AMI组减少（P＜0.05）。见表3。

　　表2 外周血白细胞计数（略）

　　与AMI组比较：1）P＜0.05；下表同

　　2.3 两组HIF1α、HO1 mRNA表达情况 预处理后1 h HIF1α mRNA开始升高，2 h达高峰，4 h后开始降低，较对应的AMI组有显著性差异（P＜0.01）。预处理后HO1 mRNA水平上升，1、2、4、6 h组较对应的心梗组有显著性差异（P＜0.01）。见表4。

　　表3 每组心肌组织中白细胞浸润数量（略）

　　表4 HIF1α和HO1 mRNA表达水平（略）

　　与AMI组比较：1）P＜0.01

　　3 讨论
　　
　　缺血预处理现象的发现为探索缺血心肌的保护及其机制开辟了崭新的领域，马利等〔2〕研究表明HIF1诱导的HO1表达可以减轻缺血再灌注对心肌的损害。HIF1是一个由α和β两个亚单位组成的异源二聚体。其中HIF1β是结构性亚基，在细胞内的表达水平相对稳定；而HIF1α是功能性亚基，其活性和表达水平受氧浓度的影响。Zhu等〔3〕用免疫组化的方法发现早期缺血性改变的区域染色加强，坏死区染色弱。本文观察到急性心肌梗死时HIF1α mRNA表达升高，但在下肢缺血预处理组HIF1α mRNA表达下降，与心梗组1、2、4 h组比较有显著差异。这说明HIF1α能保护梗死的心肌。
　　
　　HIF1可调节多种保护性基因如HO1、EPO、Glut1和VEGF等，与缺氧反应元件(hypoxia response element ，HRE)结合发挥基因调控作用。大鼠HO1基因的HRE位于启动子区约9 kb处，包括两个功能性HIF1结合位点。在大鼠主动脉平滑肌细胞中，缺氧反应与HIF1α和HIF1β的浓度增高有关〔4〕。Zampino等〔5〕发现冠状动脉结扎后，大鼠HIF1的表达明显增加。这与本实验结果一致。
　　
　　HO在体内广泛分布，其生理作用是催化血红素降解为胆绿素，后者还原成胆红素，此过程中生成CO；CO是重要的气体信使分子，而胆红素是一种抗氧化剂。朱晓光等〔6〕观察了大鼠缺血再灌注时骨骼肌中HO1的表达，认为HO1的表达对大鼠骨骼肌的缺血再灌注损伤可能具有保护作用。本研究显示下肢缺血预处理组各个时间点HO1 mRNA的表达高于心梗组对应的各时间点，推测HO1可能参与了心肌梗死的发病。
　　
　　上述研究提示，HIF1α和HO1通过缺血预处理机制对心肌产生保护作用，目前研究认为HIF1α是缺血性心脏病发病过程中的关键性调控因子，通过调节缺氧反应基因的转录，达到保护缺血心肌的作用。这种保护作用与受其调控的HO1催化游离血红素分解生成的各种代谢产物有关，由于HO1具有可诱导性，提示人为调控HO1的表达在防治心血管疾病方面具有良好的前景。

参考文献

　1 Ockaili R，Natarajan R，Salloum F，et al.HIF1 activation atTenuates post ischemic myocardial injury：role for heme oxygenase1 in modulating microvascular chemokine generation〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005；289：H5428.

　　2 马 利，杨 艳，姚尚荣，等.糖尿病大鼠心肌缺血/再灌后低氧诱导因子1和血红素加氧酶1基因表达的变化〔J〕.中国急救医学，2007；27（1）：468.

　　3 Zhu BL，Tanaka S，Ishikawa T，et al.Forensic pathologica investigation of myocardial hypoxia inducible factor1alpha，erythropoietin and vascular endothelial growth factor in cardiac death〔J〕.Leg Med，2008；10 (1)：119.

　　4 Zhen G，Zhang Z，Xu Y.The role of endogenous carbon monoxide in the hypoxic vascular remodeling of rat model of hypoxic pulmonary hypertension〔J〕.J Hua Zhong Univ Sci Tech Med Sci，2003；23(4)：35668.

　　5 Zampino M，Yuzhakova M，Hansen J，et al.Sexrelated dimorphic response of HIF1 alpha expression in myocardial ischemia〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;291(2)：H95764.

　　6 朱晓光，周君琳，张克亮，等.大鼠骨骼肌缺血再灌注时血红素氧合酶1的表达〔J〕.中国修复重建外科杂志，2003；17(1):347.