老年胃癌患者肿瘤组织体外化疗药物敏感性与COX2表达的关系

　　　　　　 作者：刘学军 檀碧波 吴胜春 韩杰

【摘要】 目的 探讨老年患者胃癌细胞对体外化疗药物敏感性与肿瘤组织环氧合酶2（COX2）表达的关系及意义。方法 对50例老年(≥60岁)胃癌患者及35例对照组患者进行MTT法肿瘤细胞原代培养药物敏感性实验并应用免疫组化法检测COX2表达，同时检测肿瘤组织多药耐药因子P糖蛋白（Pgp）、谷胱甘肽S转移酶π（GSTπ）、DNA拓扑异构酶Ⅱα（TopoⅡα）蛋白的表达。结果 5FU、LOHP、eADM、MMC、VCR对老年患者肿瘤细胞的抑制率低于对照组（均P<0.05）。老年组COX2表达高于对照组（P<0.05）；老年组多药耐药相关因子Pgp、GSTπ表达明显高于对照组（均P<0.05），对照组TopoⅡα表达明显高于老年组（P<0.01）；老年组COX2的表达与Pgp、GSTπ均有正相关性（均P<0.05），而与TopoⅡα表达呈负相关（P<0.05）；在对照组中，仅发现COX2的表达与Pgp有正相关性（P<0.05）。老年胃癌患者COX2的表达与5FU、PTX、LOHP、eADM对肿瘤细胞的抑制率呈负相关（均P<0.05)；而对照组COX2的表达则与5FU、HCPT、VCR对肿瘤细胞的抑制率有负相关关系（均P<0.05）。结论 老年胃癌患者肿瘤细胞较对照组有更强的多药耐药性，这可能与老年患者COX2表达更强有关。

【关键词】 胃肿瘤；老年人；化疗药敏性； 环氧合酶2；多药耐药相关因子

化疗在胃癌综合治疗中占有重要地位，而肿瘤多药耐药 (multidrugs resistance，MDR)的存在严重影响化疗效果，探讨胃癌MDR机制并寻找逆转靶点已成为肿瘤研究的热点。研究证实环氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)与肿瘤MDR关系密切，COX2逆转剂可有效逆转肿瘤MDR表型〔1〕。由于老年人在肿瘤MDR方面有其特征〔2〕，在化疗中应根据其特点选择合适的化疗方案。而关于COX2在老年患者胃癌组织中表达情况及其与体外化疗药物敏感性的关系尚未见报道。本研究检测了胃癌肿瘤细胞体外化疗敏感性及COX2、多药耐药相关因子的表达，并对其关系及意义进行了研究。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 2006年10月至2008年12月在我科住院手术并经病理证实的老年胃癌患者50例（≥60岁），其中男34例，女16例，年龄60～83〔平均（68±8.3）〕岁。取同期于我科住院手术并经病理证实的低龄消化道肿瘤患者35例（<60岁）作为对照组。所有病例术前均未接受放化疗。每例肿瘤原发灶、相应淋巴结转移灶标本均经中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，经苏木素伊红（HE）染色病理诊断。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 肿瘤细胞原代培养药物敏感性实验 取新鲜切除肿瘤组织0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm置入双抗培养液，2 h内行药敏实验。瘤组织用细胞分离器调浓度为5×105个/ml。培养液为DMEM培养基（GIBCO公司产品），细胞培养板为泰伦生物公司专利产品（ZL03236962.X）。10种受试药物为5氟尿嘧啶（5FU）、足叶乙甙（VP16）、羟基喜树碱（HCPT）、紫杉醇（PTX）、奥沙利铂（LOHP）、顺铂（CDDP）、表阿霉素（eADM）、吡喃阿霉素（THP）、丝裂霉素（MMC）、长春新碱（VCR），每种药物设2个平行孔。药物终浓度为血浆峰值药物浓度〔3〕。药敏检测板接种细胞悬液200 μl/孔，微量振荡器振荡混匀，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养48 h，加四甲基偶唑蓝（MTT）（5 mg/ml）20 μl /孔，继续培养3～24 h，终止培养时间为显微镜下观察MTT还原形成兰色针状结晶。细胞培养板1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO) 100 μl/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪570 nm测各孔A值。肿瘤细胞平均抑制率（IR）=（1给药孔平均A值/对照孔平均A值）×100%。

　　1.2.2 免疫组化染色 鼠抗人COX2、P糖蛋白(Pgp)、谷胱甘肽S转移酶(GSTπ)、DNA拓扑异构酶(TopoⅡα)单克隆抗体及免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物技术公司（美国ZYMED公司产品），采用免疫组化（SP）法对上述指标行免疫组化染色，染色步骤严格按试剂盒说明书进行操作。结果判断由两位病理医师双盲法对切片进行观察，每张切片随机取5个高倍视野（×400），每视野计数100个细胞。COX2、Pgp、GSTπ、TopoⅡα为细胞膜及（或）胞质呈棕黄色着染为染色阳性。按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别进行记分。着色强度记分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。肿瘤细胞阳性细胞率记分标准：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分；两种记分标准所得分值的乘积为0或1表示阴性（-），2～3为弱阳性（+），4～7阳性（），≥8强阳性（）。

　　1.3 统计学处理 应用SAS8.0统计软件分析实验数据。计量资料采用配对t检验，等级资料使用Wilcoxon配对秩和检验、双变量相关分析并计算Spearman等级相关系数。

　　2 结果

　　2.1 两组患者肿瘤细胞抑制率的比较 10种常用化疗药物对肿瘤细胞抑制率中，5FU、LOHP、eADM、MMC、VCR 5种药物对老年组胃癌细胞的抑制率明显低于对照组（均P<0.05）。见表1。

　　2.2 胃癌患者COX2与耐药相关因子表达的关系 老年组COX2表达高于对照组（P=0.010 9）；多药耐药因子Pgp、GSTπ在老年患者中的表达明显高于对照组（P=0.018 4、P=0.035 1）；对照组中多药耐药因子TopoⅡα表达明显高于老年组（P=0.001 6）。相关分析显示，老年胃癌患者COX2的表达与Pgp、GSTπ均有正相关性（r=0.425 4；P=0.000 2；r=0.309 4；P=0.028 8），而与TopoⅡα表达呈负相关（r=-0.287 6；P=0.042 8）；在对照组中，仅发现COX2的表达与Pgp有正相关性（r=0.348 2；P=0.040 3），与GSTπ、TopoⅡα表达则无明显关系（r=0.158 6；P=0.362 8；r=0.074 2；P=0.671 9）。见表2。

　　2.3 胃癌患者COX2与化疗药物对肿瘤细胞抑制率的关系 经双变量相关分析，结果显示老年胃癌患者COX2的表达与5FU、PTX、LOHP、eADM对肿瘤细胞的抑制率呈负相关（r分别为-0.503 7、-0.335 6、-0.423 4、-0.296 8；P分别为<0.001、0.017、0.002、0.036）；而对照组COX2的表达则与5FU、HCPT、VCR对肿瘤细胞的抑制率有负相关关系（r分别为-0.401 4、-0.344 6、-0.428 6；P分别为0.017、0.043、0.010）。

　　表1 10种药物对两组胃癌细胞抑制率的比较（略）

　　表2 老年胃癌组织COX2与多药耐药相关因子表达的相关性分析（略）

　　3 讨论
　　
　　MDR表现为同组织学类型、同期别的肿瘤在不同个体之间对化疗药物敏感性的不同。有报道证实，急性髓系白血病老年患者对化疗药物具有更强的抗药性，预后也更差〔4〕，说明老年患者在某些肿瘤的MDR方面有自己的特点。本研究结果显示，5FU、LOHP、eADM、MMC、VCR 5种药物对老年组胃癌细胞的抑制率明显低于对照组，且这些药物多为目前胃癌化疗的一线药物，其他5种药物对肿瘤的抑制率则无明显变化，结果提示胃癌细胞对化疗药物耐药性与患者年龄有关，老年人具有较强的耐药性。为进一步探讨老年患者耐药性更强的机制，本研究检测了胃癌组织Pgp、GSTπ、TopoⅡα蛋白的表达。这些蛋白被视为经典MDR相关因子，其引起的MDR表型是产生内在性或获得性耐药的标志，肿瘤的化疗效果与多种耐药相关因子表达有关〔5〕：由Pgp介导的耐药途径通过药泵作用将包括多种药物外排而产生多药耐药〔6〕；GSTπ可通过酶结合方式（解毒作用）将多种化疗药物从体内排出而导致MDR〔7〕；TopoⅡα是肿瘤化疗的重要靶点，其表达上调可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性〔7〕。本研究检测的结果发现，老年患者Pgp、GSTπ表达高于对照组，而TopoⅡα表达与对照组比较则明显降低，与本文前期研究的结果相符〔2〕，说明老年患者肿瘤细胞可通过多种途径作用于化疗药物使之失效，从而导致更强的MDR，严重影响老年患者的化疗效果。
　　
　　COX2是一种诱导酶，在消化道肿瘤组织中表达增高，与肿瘤的侵袭、转移关系密切。目前研究发现，COX2抑制剂可明显逆转胃癌细胞的MDR〔1〕，说明COX2与胃癌MDR有关。本研究发现，老年患者COX2表达较对照组更强。COX 2表达与部分化疗药物对肿瘤细胞的抑制率呈负相关；与老年患者COX2表达有负相关的药物大部分与对照组不同，且所有药物均未发现抑制率与COX2表达有正相关关系。这说明COX2可能通过调控某些MDR相关因子的表达导致胃癌MDR的产生，也提示老年胃癌组织COX2所调控的MDR因子及参与的耐药途径与对照组可能有所不同，导致老年人肿瘤组织具有更强的耐药性。对细胞系的研究表明，COX2可调控Pgp的表达〔8〕。其他研究也证实COX2与GSTπ、TopoⅡα的表达调控也有密切关系〔9，10〕。本结果显示，老年患者COX2的表达与Pgp、GSTπ具有明显正相关性，与TopoⅡα表达则有负相关关系；而对照组则仅发现COX2的表达与Pgp具有正相关性。这些结果证实COX2与胃癌MDR有关；COX2的强表达可能是老年患者具有更强化疗耐药性的原因之一。进一步从分子水平深入探讨COX2在MDR调节网络中的位置和作用将有助于更加深入的了解胃癌MDR的成因及调控，并有可能对逆转老年胃癌MDR提供方向和依据。
　　
　　由于肿瘤化疗药敏实验和临床化疗效果具有显著一致性〔11〕，因此明确老年胃癌患者肿瘤化疗药敏实验结果与COX2的关系可为个体化化疗选择化疗方案、提高肿瘤综合治疗效果提供相对准确的依据。但研究尚处于初级阶段，今后应针对老年胃癌患者的MDR特点进行深入研究。

参考文献

　　1 Liu H，Huang P，Xu X，et al.Anticancer effect of celecoxib via COX2 dependent and independent mechanisms in human gastric cancers cells〔J〕. Dig Dis Sci，2009；54(7):141824.

　　2 檀碧波，韩 杰，吕炳蓉，等.p53、Pgp、GSTπ和TopoⅡα在老年消化道肿瘤中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(7):8502.

　　3 韩 杰，檀碧波，耿 玮，等.消化道肿瘤组织中Pgp、凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药敏性的关系及其意义〔J〕.癌症，2008；27(11)：116671.

　　4 Klepin HD，Balducci L.Acute myelogenous leukemia in older adults〔J〕. Oncologist，2009；14(3):22232.

　　5 张 雁，周继胜，李 非，等.胃肠道肿瘤新辅助化疗疗效分析及多药耐药标志物的检测〔J〕.中国普外基础与临床杂志，2003；10(2)：1403.

　　6 Zhang Y，Qu X，Hu X，et al.Reversal of Pglycoproteinmediated multidrug resistance by the E3 ubiquitin ligase Cblb in human gastric adenocarcinoma cells〔J〕.J Pathol，2009；218(2):24855.

　　7 Shi H，Lu D，Shu Y，et al.Expression of multidrugresistancerelated proteins Pglycoprotein，glutathioneStransferases，topoisomeraseII and lung resistance protein in primary gastric cardiac adenocarcinoma〔J〕.Cancer Invest，2008；26(4):34451.

　　8 Zrieki A，Farinotti R，Buyse M.Cyclooxygenase inhibitors down regulate Pglycoprotein in human colorectal Caco2 cell line〔J〕.Pharm Res；2008；25(9):19912001.

　　9 朱风尚，陈锡美，王毅军，等.塞来昔布增强胃癌化疗药物疗效的机制研究〔J〕.中国临床药理学杂志，2008；24(3):2379.

　　10 Segawa E，Sakurai K，Kishimoto H，et al.Expression of cyclooxygenase2 and DNA topoisomerase II alpha in precancerous and cancerous lesions of the oral mucosa〔J〕.Oral Oncol，2008；44(7):66471.

　　11 Kodera Y，Ito S，Fujiwara M，et al.In vitro chemosensitivity test to predict chemosensitivity for paclitaxel，using human gastric carcinoma tissues〔J〕.Int J Clin Oncol，2006;11(6):44953.