淋巴归巢受体P选择素、CD44、α6β1在宫颈癌中表达与淋巴转移关系研究

　　　　 作者：张素贞 张凡 常永霞 张九鸿 赵秀芳 成日青

【摘要】 目的 探讨P选择素（Pselectin）、CD44、整合素α6β1对宫颈癌淋巴转移的作用。方法 应用免疫组织化学方法对比检测35例宫颈鳞状细胞癌原发灶及其淋巴转移灶中Pselectin、CD44、α6β1的表达。结果 与原发灶相比，淋巴转移灶中Pselectin阳性率显著降低（P<0.05），CD44阳性率无显著变化（P=1.230 5），ICAM1阳性率则显著增高（P<0.01）。原发灶中Pselectin与CD44、Pselectin与ICAM1表达水平均存在显著正相关性（r=0.873 7，P<0.01；r=0.795 7，P<0.01），而CD44与α6β1则呈明显负相关（r=-0.658 3，P<0.01）；淋巴转移灶中Pselectin、CD44、α6β1表达水平之间均不存在相关关系；Pselectin原发灶与淋巴转移中表达水平存在明显正相关（r=0.753 4，P<0.01），CD44原发灶与淋巴转移中表达水平之间无明显相关，α6β1原发灶与淋巴转移中表达水平之间存在明显负相关（r=-0.536 1，P<0.01）。原发灶中Pselectin表达与肿瘤分化、淋巴结转移存在正相关（r=0.842 0，P<0.01和r=0.768 9，P<0.01）；CD44表达与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移之间存在正相关（r=0.678 2，P<0.01；r=0.863 4，P<0.01）；α6β1表达与淋巴结转移存在正相关（r=0.654 8，P<0.01）。结论 Pselectin、CD44、α6β1都与宫颈癌淋巴转移相关，其中Pselectin、CD44在淋巴转移的始动阶段发挥重要作用。

【关键词】 淋巴归巢；归巢受体；Pselectin；CD44

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of Pselectin， CD44 and α6β1 on metastasis of cervical carcinoma. Methods The expressions of Pselectin， CD44 and α6β1 were detected by immmunohistochemistry in 35 cases original carcinoma and lymph metastasis. Results The expression ratio of Pselectin in original carcinoma was higher than that of lymph metastasis (P＜0.05). The expression ratio of CD44 had no difference between original carcinoma and lymph metastasis (P=1.230 5). The expression ratio of α6β1 in original carcinoma was lower than that of lymph metastasis (P＜0.01). There were positive correlation between the expression of Pselectin and CD44， Pselectin and α6β1 in original carcinoma（r=0.873 7 and 0.795 7， all P＜0.01）. There were negative correlation between the expression of CD44 and α6β1 in original carcinoma（r=-0.658 3， P＜0.01）. There were no correlation among the expression of Pselectin， CD44 and α6β1 in lymph metastasis. There was positive correlation between the expression of Pselectin in original carcinoma and lymph metastasis （r=0.753 4， P＜0.01）. There was no correlation between the expression of CD44 in original carcinoma and in lymph metastasis carcinoma. There were negative correlation between the expression of α6β1 in original carcinoma and lymph metastasis（r=-0.536 1， P＜0.01）. There were positive correlation between the expresssion of Pselectin and tumor differentiation and lymph metastasis（r=0.842 0 and 0.768 9， all P<0.01）. There were positive correlation between the expresssion of CD44 and invasive depth and lymph metastasis （r=0.678 2 and 0.863 4， all P<0.01）. There were positive correlation between the expresssion of α6β1 and lymph metastasis（r=0.654 8， P<0.01）. Conclusions Pselectin， CD44 and α6β1 all take part in cervical carcinoma’s lymph metastasis. Pselectin and CD44 play key role in early lymph metastasis.
　　
　　【Key words】 Lymph homing; Homing recptor; Pselectin; CD44

　　淋巴归巢是淋巴细胞循环和参与炎症及其免疫反应的重要过程，关键环节是淋巴细胞表面黏附分子与血管内皮细胞相互黏附，进入血液循环，到达靶器官后再黏附游出血管发挥免疫作用的过程。淋巴归巢受体（lymphocyte homing receptor，LHR)是淋巴细胞表面的黏附分子，在其中发挥重要作用。已有的研究发现多种肿瘤中存在LHR的表达，与肿瘤的淋巴和血液转移密切相关〔1，2〕。宫颈癌预后影响主要因素是淋巴转移，但转移机制尚不清楚，我们前期实验观察到LHR在宫颈癌中表达，推测宫颈癌在分化过程中为逃避免疫系统监控和攻击，模拟淋巴归巢过程，表达归巢受体，完成淋巴道转移，Pselectin、CD44、α6β1是决定淋巴细胞向外周淋巴结选择性归巢的归巢受体，在宫颈癌中鲜见报道，故选取这最具代表性的三种受体进行检测，希望为宫颈癌淋巴转移的分子机制研究提供初步依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料 收集本院1998年1月至2005年12月住院患者中临床病理资料齐全的子宫颈鳞状细胞癌35例，资深病理医师对切片进行复习确诊，年龄25～69(平均51)岁。其中大细胞非角化型癌（高分化）8例，角化型癌（中分化）19例，小细胞非角化癌（低分化）8例。所有肿瘤均存在淋巴结转移，其中单侧髂窝淋巴结转移23例，双侧淋巴结转移12例。肿瘤直径1.2～6 cm；浸润癌中外生性生长25例，浸润性生长11例。

　　1.2 免疫组织化学染色 Pselectin、CD44、α6β1一抗试剂均购自北京中山试剂公司。主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，采用专用微波炉进行抗原微波热修复，正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜，二抗 、三抗各1 h，DAB显色10～15 min，复染核脱水透明，中性树胶封片。结果判断:着色细胞<10%为阴性，≥10%为阳性。α6β1定位在肿瘤细胞质，Pselectin阳性表达定位在内皮细胞膜或细胞浆，CD44阳性表达定位在细胞膜。阳性对照片由试剂公司提供。采用HIPAS100图像分析软件对所有切片进行图像分析，每张切片随机选取10个着色典型区域且不重复的视场，高倍镜（400倍）下测量每个视场中阳性单位，取其均数即为该切片的着色强度。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。不同组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标的表达水平以及与临床病理参数之间作直线回归相关分析。

　　2 结果

　　2.1 各个指标原发灶与淋巴转移灶阳性表达率比较 Pselectin在宫颈癌原发灶和淋巴转移灶中阳性表达率分别为56%（20/35）和34%（12/35），淋巴转移灶中阳性率明显低于原发灶（P<0.05）；CD44在宫颈癌原发灶和淋巴转移灶中阳性表达率分别为60%（21/35）和51%（18/35），淋巴转移灶中阳性率与原发灶无明显区别（P=0.230 5）；α6β1在宫颈癌原发灶和淋巴转移灶中阳性表达率分别为36%（13/35）和64%（22/35），淋巴转移灶中阳性率明显高于原发灶（P<0.01）。

　　2.2 各指标在原发灶中表达水平与临床病理参数相关分析 原发灶中Pselectin的表达水平与肿瘤分化程度(r=0.842 0)、淋巴结转移(r=0.184 0)之间存在显著正相关；CD44表达水平与肿瘤侵犯深度(r=0.678 2)、淋巴结转移(r=0.863 4)之间存在显著相关；α6β1表达水平与淋巴结转移(r=0.654 8)之间存在显著正相关。见表1。

　　表1 原发灶Pselectin、CD44、α6β1表达水平与临床病理参数之间相关分析（略）

　　1)与高分化程度比较；2)与侵犯内1/2肌层比较；3)与单侧淋巴结转移比较；4)与淋巴结转移＜5枚比较：P＜0.01

　　2.3 各个指标在原发灶和淋巴转移灶中表达水平相关分析 Pselectin与CD44、Pselectin与α6β1在原发灶中表达水平之间存在明显相关（r=0.873 7，P<0.01；r=0.795 7，P<0.01），CD44、α6β1在原发灶中表达水平呈明显负相关（r=-0.658 3，P<0.01）；淋巴转移灶中Pselectin、CD44、α6β1表达水平之间均不存在相关；Pselectin原发灶与淋巴转移中表达水平之间存在明显相关（r=0.753 4，P<0.01），CD44原发灶与淋巴转移中表达水平之间无明显相关，α6β1原发灶与淋巴转移中表达水平之间存在明显负相关（r=-0.536 1，P<0.01）。

　　3 讨论
　　
　　Pselectin是细胞黏附分子选择素家族的成员之一，仅在炎症细胞表面表达，决定淋巴细胞向外周淋巴结选择性归巢，其相应配体为特异性表达于外周淋巴结血管地址素（perpheral lymphonode vascular addressin，PNAd)，Pselectin分子与PNAd相结合介导了淋巴细胞与外周淋巴结血管内皮细胞最初的黏附，随后参与黏附与穿越过程的黏附分子主要有α6β1及CD44/MAd分子〔1～4〕。本研究结果说明Pselectin参与了宫颈癌的淋巴转移，而且Pselectin的表达在原发灶向淋巴结转移和从转移淋巴结向更远淋巴结转移过程中均发挥作用，且在原发灶转移中作用更加突出；宫颈癌的淋巴转移过程模拟淋巴归巢过程，不仅表达LHR，还需要包括CD44和α6β1在内的多种黏附分子的参与，而且肿瘤分化程度越低，LHR表达水平越高，肿瘤更易淋巴转移。
　　
　　研究〔5～7〕证明CD44s与细胞间黏附、细胞基质相互作用有关，编码正常T细胞表面的CD44分子可以通过识别毛细血管后静脉内皮上的透明质酸而回到特定的淋巴组织，CD44s丢失时提示细胞间黏附能力减弱，易于浸润转移。本实验结果说明CD44参与了宫颈癌的淋巴转移，而且在淋巴转移过程中与Pselectin协同发挥作用。肿瘤细胞的CD44蛋白连接细胞外基质及其基底膜透明质酸，使肿瘤细胞将自身锚定在宿主组织的细胞外基质或基底膜上，为肿瘤侵袭奠定基础，此外CD44与Pselectin协同作用，能够介导淋巴细胞与血管内皮细胞结合，使淋巴细胞穿过血管壁返回淋巴组织，使癌细胞获得淋巴细胞伪装，令机体免疫细胞不能识别，易进入淋巴及血液循环系统中，从而获得较强的浸润转移能力。
　　
　　α6β1是细胞表面黏附分子整合素中的重要组成分子，目前研究最多的黏附分子，它广泛表达于单核细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和人体癌细胞表面，能通过与其配体β2整合素LFA1（淋巴细胞功能相关抗原 CD11α/CD18）和Mac1结合，从而促进T细胞活化及白细胞从血管内向炎症部位浸润，在炎症和免疫反应中起重要作用〔8，9〕。中性粒细胞表面的黏附分子与α6β1的表达影响着T细胞的跨内皮移行作用，且这两种分子有协同作用〔10～12〕。本研究说明α6β1参与宫颈癌淋巴转移。Pselectin与α6β1在原发灶中表达水平之间存在明显相关，表明两者在淋巴转移中起协同作用。CD44、α6β1在原发灶中表达水平呈明显负相关，未见相关文献报道，推测这两种参与淋巴转移的因子的作用可能存在分子机制方面的不同，甚至有部分的拮抗作用;α6β1原发灶与淋巴转移灶中表达水平之间存在明显负相关，推测α6β1参与宫颈癌淋巴转移的阶段与其他指标不同，在原发灶向局部淋巴结的转移中作用不显著；而在淋巴结转移灶中的高表达以及阳性率较原发灶高，表明α6β1可能在肿瘤淋巴转移后期阶段（既从淋巴结转移灶向远处淋巴结转移）起作用，由于大多医院临床标本未进行由近及远的淋巴结活检的统计分析，因此目前尚无这方面的文献支持，仍需深入研究证实笔者的推测。
　　
　　总之，本次实验仅对宫颈癌的淋巴转移机制进行了初步探讨，认为子宫颈癌中存在LHR Pselectin、CD44、α6β1的表达，并与淋巴转移过程密切相关，当然肿瘤淋巴转移机制还涉及肿瘤组织中淋巴管扩张、新生等现象，且分子机制及其相互关系十分复杂，仍需深入研究，相信以此为主旨的研究必将为临床研究提供新的分子靶点，为阻止宫颈癌的转移提供分子基础。

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