Exendin4对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞增殖的影响

【摘要】 目的 观察Exendin4对链脲佐菌素(STZ)造模糖尿病(DM)大鼠的空腹血糖(FBG)、胰岛功能及胰岛β细胞增殖数目表达的影响。方法 SD大鼠高脂喂养结合小剂量腹腔注射STZ(35 mg/kg)，制备2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，随机分成DM组及Exendin4治疗低、中、高剂量组，并设立正常对照组，Exendin4给药6 w后处死大鼠，心脏取血测FBG、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素，取胰腺组织切片作HE 染色，胰岛素抗体免疫组化、增殖细胞核抗原染色（PCNA），计算胰岛β细胞增殖率。结果 Exendin4各剂量组胰岛素表达阳性的β细胞增殖率较DM组增加(P<0.01)；Exendin4高剂量组与DM组比较，FBG和HbA1c水平明显降低(P<0.01)。血清胰岛素增加，中、低剂量组之间无统计学差异但与DM组有统计学差异。结论 Exendin4能够促进DM大鼠胰岛β细胞增殖，改善血糖代谢和胰岛素抵抗。

【关键词】 Exendin4；糖尿病；胰岛β细胞；增殖率

胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是2型糖尿病(T2DM)的发病机制，DM β细胞数目相对或绝对缺乏是其发病的主要原因，传统的DM治疗药物通过刺激胰岛素分泌来降低血糖，加重了β细胞的负担，容易引起β细胞功能衰竭，因此若能促进β细胞增生，提供具有完整功能的β细胞，将有可能从根本上治疗DM。胰高糖素样肽1受体激动剂（GLP1）是近十年DM药物领域内备受关注的研究热点〔1，2〕，其降糖作用已得到全世界的公认，但其半衰期短，静脉注射不足5 min，限制了它的相关临床应用。其长效类似物Exendin4（商品名Exenatide）已经获得FDA批准上市。Exendin4是一种从蜥蜴的唾液腺分泌物中提取的物质，由39个氨基酸残基组成，53%的氨基酸序列与GLP1同源。Exendin4同样能促进DM小鼠胰岛素分泌，降低血糖〔3〕。本研究观察Exendin4注射后对STZ造模T2DM大鼠空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素以及胰岛细胞增殖率的影响，探讨Exendin4保护胰岛功能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及饲料

　　体重190～230 g成年雄性SD大鼠及基础饲料由徐州医学院实验动物中心提供。高脂饲料组成的各成分质量百分比:基础饲料67.75%，猪油10%，蔗糖20％，胆固醇2.5%，胆盐0.25%。

　　1.2 试剂

　　链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司;Exendin4购自TOCRIS公司；胆固醇、胆盐购自南京生化制药厂；柠檬酸、柠檬酸三钠购自上海前尘生物有限公司；胰岛素放免试剂盒购自北京市原子高科生物技术有限公司；胰岛素抗体购自武汉博士德生物技术有限公司；小鼠两步法试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

　　1.3 主要仪器

　　罗氏血糖仪及血糖试纸(瑞士罗氏公司)，Olympus AU2700全自动生化分析仪(日本Olympus公司)，BIORAD D10全自动糖化血红蛋白仪(美国BIORAD公司)。胰岛素放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所)，GC911γ放射免疫计数器（中国科学技术大学科技实业总公司）。

　　1.4 DM动物模型复制、分组及处理

　　48只成年雄性SD大鼠(190～230) g喂养于动物中心屏障系统中，室温20～25℃，相对湿度62%～80%，光照规律12 h。基础饲料喂养适应7 d后，将实验动物随机分为正常对照(NC)组和高脂饮食组。NC组8只，基础饲料喂养到实验结束；高脂饮食组40只，高脂饲料喂养1月后，左下腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg（STZ 4℃避光保存，用0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液在冰浴下配制成10 g/L STZ溶液，调至pH 4.4，现配现用）。分别于给药1及2 w后取尾静脉血，强生血糖仪检测FPG，FBG≥16.7 mmol/L确定为成模，本实验成模35只，取其中32只（去除体重过轻及血糖过高的3只）随机分为低剂量治疗(EL)组、中剂量治疗(EM)组、高剂量治疗(EH)组和DM组;各组间FBG及体重无统计学差异。EL、EM、EH组分别腹腔注射Exendin4 2、4、8 μg/kg（灭菌注射用水配置成1 μg/ml）1次/d，DM组和NC组给予腹腔注射生理盐水0.7 ml。药物治疗共6 w，实验期间动物自由饮水、进食。每周称体重1次，根据体重变化调整给药量。每两周取动物尾静脉血测FBG。治疗的第6周末，夜间禁食14 h，次日清晨称重后予20 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，心脏采血2～3 ml，普通管3 000 r/min，离心15 min，取血清-20℃保存，用于检测血清生化学指标。然后将动物处死，取胰尾组织1 cm×1 cm放入100 ml/L中性甲醛溶液固定，以备病理组织学观察和免疫组织化学染色。

　　1.5 血生化指标检测

　　FBG测定采用葡萄糖氧化酶法； HbA1c采用高压液相色谱法；甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）采用Olympus AU2700全自动生化仪检测；血清胰岛素采用放射免疫试剂盒检测。

　　1.6 胰岛HE染色和免疫组化染色

　　胰腺组织置于中性甲醛溶液中固定24 h，取出作石蜡包埋，切片厚4 μm。HE染色后，显微镜下观察并拍照。取胰腺组织石蜡切片行非生物素二步法免疫组化染色:组织切片脱腊至水，PBS冲洗，微波修复（组织切片置于0.1 mol/L枸橼酸钠溶液中最大火2.5 min使沸腾，最小火10 min，自然冷却至室温），3％的h3O2室温10 min，灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗。滴加一抗:胰岛素（小鼠单抗）1∶100，PCNA（小鼠单抗）1∶40，4℃孵育过夜，阴性对照片用PBS代替一抗，按试剂盒操作说明进行免疫组化反应，用DAB系统显色2～5 min。苏木素衬染、脱水透明后，中性树胶封片，显微镜下观察。免疫组化染色结果：胰岛素表达于胞质，PCNA表达于胞核，阳性表达均为棕黄色颗粒；用 Olympus 显微摄像系统采集图片，采集图像在同一光强度，同一放大倍数下进行，其中每张切片取5个完整的胰岛。对所采集图片用 Image ProPlus 6.0 软件进行处理。

　　1.7 统计学处理

　　数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 Exendin4对DM大鼠血糖及血清胰岛素的影响

　　STZ造模后，DM大鼠的FPG水平明显高于NC组，DM组及各治疗组间血糖均值无统计学差异。Exendin4治疗6 w后，各治疗组FPG水平较治疗前显著降低，且与DM组比较亦显著降低(P<0.01)。各治疗剂量组HbA1c较NC组显著降低，其中与EH组相比，EM、EL及DM组显著增高(P<0.01)；与DM组比较，各治疗剂量组血清胰岛素水平显著增高，而TG水平则显著降低，且DM组TG水平较NC组显著增高(P<0.01)，TC各组间无显著差异，见表1。表1 Exendin4治疗前后各组FBG及治疗后胰岛素、血脂水平比较及对胰岛素阳性表达百分率及β细胞增殖率的影响(略)

　　2.2 Exendin4对DM大鼠胰岛病理组织学影响

　　HE染色低倍镜下可见NC组大鼠胰腺胰岛数量较多，形态圆润饱满，形状规则，胰岛内细胞排列整齐，大小一致，分布均匀。细胞核呈紫蓝色，大而圆，核清晰。核仁明显，胞浆丰富。DM及各治疗组胰岛密度不同程度减低，数量减少，分布稀疏，形状不规则，胰岛细胞萎缩，排列紊乱。高倍镜下见胰岛轮廓欠圆润，边缘不整，胰岛细胞发生退行性改变，胞质着色浅，胞核变形、固缩，见图1。

　　2.3 Exendin4对DM大鼠胰岛素阳性表达细胞百分率的影响
　　胰岛素抗体免疫组化染色，NC组胰岛形态完整。β细胞占据胰岛细胞的绝大部分。位于胰岛的中央，棕黄色的颗粒分布在胰岛β细胞的细胞质内，含量丰富，较致密，着色深。DM组及各治疗组胰岛结构遭到不同程度破坏，边缘不整齐，β细胞数量和细胞质内棕黄色颗粒均明显减少，见图2。与DM组相比，EH、EM、EL组胰岛素阳性表达率显著增高，比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

　　2.4 Exendin4对DM大鼠胰岛β细胞增殖率的影响

　　PCNA染色计算胰岛细胞增殖率，PCNA阳性细胞胞核呈棕黄色，同时对照连续切片中胰岛素染色阳性的细胞定为增殖的β细胞，见图3。与DM组比较，EH、EM及EL组胰岛β细胞增殖率显著增高(P<0.01)，见表1。

　　3 讨 论
　　
　　研究发现，GLP1能刺激胰岛β细胞的增殖和分化、抑制其凋亡，具有促进胰岛素释放，降低血糖，改善糖耐量的作用〔4〕。多项体内外研究显示GLP1及其类似物Exendin4能增加β细胞数量、改善胰岛β细胞功能，可诱导胰岛和胰管内干细胞分化为胰岛β细胞。有研究发现〔5〕，在两周半的观察期内，Exendin4可使切除90%～95%胰腺的T2DM模型大鼠的血糖水平维持在空白对照组血糖水平的60%，且实验动物的胰岛细胞加速增殖分化而数量增加，表明Exendin4在体内可促进胰岛增殖并改善其功能。Exendin4促进β细胞增殖可能通过以下途径:(1)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其下游的细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)或蛋白激酶C(PKC);(2)cAMP/蛋白激酶A(PKA)介导的pdx1的转录〔6〕。转录因子胰腺十二指肠同源盒(PDX1)是胰腺内分泌细胞功能发育过程所必需的。在胰腺的胚胎发育期，PDX1广泛存在于内、外分泌腺体中，成年期主要表达于β细胞。促进PDX1表达可能是Exendin4诱导β细胞的增殖和分化，增加β细胞量，达到长期良好控制血糖的机制之一。Exendin4促进β细胞总量的增加不是通过增大自身β细胞的体积(细胞肥大)，而是通过促进残存胰岛细胞的增殖和促进前体细胞(未分化的胰腺导管上皮细胞)分化为分泌胰岛素的β细胞完成的，并且以后者更为重要，因胰腺导管上皮细胞上具有GLP1受体，GLP1/Exendin4能与其结合后刺激β细胞增生〔7〕。本实验中EH组HbA1c与中、低剂量组及DM组有显著性差异，说明在Exendin4治疗过程中EH组血糖得到较好控制。
　　
　　PCNA是一种核蛋白，为细胞合成DNA所必需。G1期逐渐增多，S期达高峰;细胞动力学研究表明其表达及合成与细胞增生周期有关，因此能准确地反映细胞的生长速度和状态〔8，9〕。胰岛素抗体及PCNA免疫组化显示经过Exendin－4治疗后各治疗组大鼠胰岛β细胞有不同程度地增生是改善胰岛功能，降低血糖，治疗DM的主要机制。本实验观察到的结果显示Exendin4可通过促进胰岛β细胞增殖，促进胰岛素分泌，达到保护胰岛β细胞功能，降低血糖，治疗DM的作用。随着Exendin4剂量的增加，促进胰岛素增殖作用增强。

参考文献

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