胰岛素在大鼠深慢波睡眠调节中的作用

　　　　 作者：张瑾 李春华 汪凯 尹豆 王烈成 赵乐章 张景行

【摘要】 目的 探讨胰岛素对大鼠睡眠特别是深慢波睡眠的影响。 方法 根据SD大鼠海马CA1区注射试剂及剂量的不同，分为对照组、0.05 IU胰岛素组、0.1 IU胰岛素组和0.2 IU胰岛素组；采用脑立体定位、核团插管、微量注射和多导睡眠描记技术观察海马CA1区微量注射胰岛素对大鼠睡眠觉醒周期的影响。 结果 海马CA1区微量注射0.05 IU的胰岛素对大鼠睡眠觉醒周期及睡眠的深度无明显影响。微量注射0.1 IU的胰岛素后，觉醒时间减少，总睡眠时间增多；与对照组比较，慢波睡眠时间增加18.1%（P<0.05），且主要是浅慢波睡眠成分增加22.0%（P<0.01）。微量注射0.2 IU的胰岛素后，觉醒时间减少，总睡眠时间增多，睡眠加深；与对照组比较，慢波睡眠时间增加29.8%（P<0.01），其中浅慢波睡眠时间增加21.6%（P<0.01），深慢波睡眠时间增加53.2%（P<0.05）。结论 胰岛素在海马参与睡眠的调节且具有促眠作用，胰岛素对大鼠睡眠深度的影响与注射的剂量呈正相关。

【关键词】 胰岛素；海马；睡眠；多导睡眠描记术

多导睡眠图研究发现老年人、原发性失眠症和精神障碍引起的睡眠紊乱，其特征均表现为深慢波睡眠时间减少甚或缺如，可见深慢波睡眠在正常睡眠和睡眠障碍中起着极为重要的作用。Valatx等〔1〕报道表达人胰岛素基因的转基因小鼠慢波睡眠明显增加，提示胰岛素可能为调节睡眠的物质之一。中枢神经系统中广泛存在胰岛素受体，但胰岛素参与睡眠调节的具体机制目前尚不清楚。胰岛素在海马内参与学习、记忆功能的调节〔2〕，海马又是与睡眠调节密切相关的脑区。本研究通过脑立体定位技术、多导睡眠描记技术和海马微量注射等方法，探讨胰岛素在大鼠睡眠调节特别是深慢波睡眠调节中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物 SPF级雄性成年SD大鼠43只，体重200～250 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。大鼠随机分为对照组、0.05、0.1和0.2 IU胰岛素组，每组9只。单独饲养，活动不受限制，自由摄食与饮水。所有大鼠均置于明/暗各12 h（光照06∶00～18∶00）的通风环境中，室温维持在20℃～24℃，安静环境下饲养适应环境7 d。

　　1.1.2 仪器及试剂 SN2型脑立体定位仪（日本Tokyo Narishige科学仪器实验室生产），ND82B型八导脑电图仪（上海医疗器械厂生产），XSD02 型光学显微镜（上海光学仪器厂生产）。戊巴比妥钠（上海化学试剂采购供应站分装厂进口分装），用蒸馏水配置成8 g/L溶液。生物合成人胰岛素注射液（100 IU/ml，丹麦诺和诺德公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠海马CA1区插管及记录电极安装 大鼠经戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，将头部固定于脑立体定位仪上，暴露颅骨，双氧水清洁颅骨表面，将外径为0.6 mm的不锈钢引导管按Paxinos 和Watson大鼠脑立体定位图谱插入双侧海马CA1区（AP:-5.8 mm、L/R:± 5.0 mm、H:7.0 mm），引导管顶端距海马CA1区 1 mm，供海马内微量注射药物和毁损用。在冠状缝前1 mm及人字缝前1 mm与颅骨中线两侧旁开1 mm交叉点处分别安装铜质螺丝钉，穿透颅骨接触到硬脑膜，用于记录皮层脑电活动。在双侧颈肌内插入银丝电极用于记录肌电活动。插管与记录电极均以牙科水泥固定于颅骨上，并将脑电和肌电电极通过电线连接到微型插座上，大鼠术后置隔音、自动控制光照记录室中休息1 w。

　　1.2.2 适应训练〔3〕 手术休息1 w后，对大鼠进行适应训练以减少因药物微量注射操作对大鼠可能造成的应激刺激。用毛巾包裹大鼠将其放置于操作者膝盖上5 min，期间模拟将药物微量注射入引导管的操作（只是在引导管中插入空的微量注射器），适应训练每天上午09∶00进行，连续7 d。

　　1.2.3 药物微量注射方法 在清醒待记录状态下进行微量注射，注射时间为上午09∶00。用尖端外径为0.3 mm的微量注射器通过引导管向大鼠双侧海马内注射生理盐水1 μl（对照组）和0.05、0.1、0.2 IU的胰岛素（实验组），在20 s内注射完毕，留针1 min以防药液溢出。

　　1.2.4 多导睡眠图记录方法 记录电极通过微型插座连接到ND82B 型八导脑电图仪上，用于同步记录脑电和肌电活动。记录前1 d进行连接以适应记录状态。为了尽可能避免大鼠24 h睡眠觉醒周期的影响，每次描记均从10∶00开始，连续记录4～6 h。

　　1.2.5 资料分析 采用30 s为一分段时间，将睡眠觉醒周期分为3期：(1) 觉醒期（W）：以额顶叶引导出低幅快波脑电和明显的肌电活动为特征；(2) 慢波睡眠（SWS）：以睡眠梭形波和高幅慢波为特征，肌电活动明显减少，其中δ波少于50%属浅慢波睡眠（SWS1），超过50%属深慢波睡眠（SWS2）；(3) 异相睡眠（PS）：以低幅快波为特征，除偶尔有肌肉抽动外，无明显肌电活动。总睡眠时间 ( TST ) 为 SWS 和 PS 之和。

　　1.2.6 组织学鉴定 所有大鼠在实验结束后用外径为0.3 mm的单极不锈钢电极插入引导管，通以2.5 mA阳极直流电10 s电损毁被注射的核团，2 w后处死内固定取脑行HE染色，做组织学定位鉴定，观察引导管轨迹顶部是否位于海马。7只大鼠因定位不在海马CA1区内已剔除。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS12.0进行统计分析，结果以x±s表示，经两样本t检验进行显著性比较。

　　2 结果

　　2.1 大鼠海马CA1区微量注射胰岛素对W和TST的影响 见图1。0.1 IU胰岛素组和0.2 IU胰岛素组W为（79.2±16.3）min和（61.8±15.1）min，与对照组〔（103.9±29.0）min〕比较，分别减少23.8%和40.5%，有显著性差异（P＜0.05或P<0.01）；0.1 IU胰岛素组和0.2 IU胰岛素组TST为（160.8±16.3）min和（178.2±15.1）min，与对照组〔（124.9±41.9）min〕比较，分别增多28.7%和42.7%，有显著性差异（P＜0.05 或P＜0.01）。0.05 IU胰岛素组W和TST分别为（89.8±17.7） min和（150.1±17.6）min，与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。

　　与对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01；下图同

　　图1 大鼠海马CA1区注射胰岛素对W和TST 的影响（略）

　　2.2 大鼠海马CA1区微量注射胰岛素对SWS和PS的影响 见图2。0.1 IU胰岛素组和0.2 IU胰岛素组SWS时间为（153.9±13.3） min和（169.1±20.3）min，与对照组〔（130.3±24.5）min〕比较，分别增加18.1%和29.8%，有显著性差异（P＜0.05 或P＜0.01）；0.05 IU胰岛素组SWS与对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。0.05 IU胰岛素组、0.1 IU胰岛素组和0.2 IU胰岛素组PS时间为（7.7±9.0）min、（6.9±6.7）min和（9.1±9.8）min，与对照组〔（5.8±6.4）min〕比较，分别增多32.8%、19.0%和56.9%，无显著性差异（P＞0.05）。

　　图2 大鼠海马CA1区注射胰岛素对SWS和PS的影响（略）

　　2.3 大鼠海马CA1区微量注射胰岛素对睡眠深度的影响 见图3。 0.1 IU胰岛素组和0.2 IU胰岛素组SWS1时间为（144.9±19.1） min和（144.3±14.3）min，与对照组〔（118.7±18.3）min〕比较，分别增加22.0%和21.6%，有显著性差异（P＜0.01）；0.2 IU胰岛素组SWS2时间为（24.8±8.1）min，与对照组〔（11.6±11.5）min〕比较，增加53.2%，有显著性差异（P＜0.05）。0.1 IU胰岛素组SWS2时间为（9.1±11.0）min，与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。0.05 IU胰岛素组SWS1和SWS2时间分别为（128.7±20.2）min和（13.8±18.2）min，与对照组比较无显著性差异（P>0.05）。

　　图3 大鼠海马CA1区注射胰岛素对SWS1和SWS2的影响（略）

　　3 讨论
　　
　　由消化道内分泌细胞合成和释放的激素，统称为胃肠激素。胃肠激素除了调节胃肠道的运动和分泌功能外，还广泛中介各种行为、躯体和内脏的功能。胰岛素属于胃肠激素，诸多研究提示胰岛素是一种与睡眠觉醒密切相关的物质：Simon等〔4〕研究发现正常人夜间8 h睡眠期间胰岛素分泌量明显增加；大鼠进食引起的行为变化称为“饱满综合征”，最终结果是入睡，而正是由于进食引起的胆囊收缩素和胰岛素的分泌，介导了这种饭后的睡眠〔5〕；另有研究报道抑制健康青年人夜间的SWS后发现〔6〕，机体对胰岛素的敏感性下降，且下降的程度与SWS减少的程度明显相关。
　　
　　上述研究表明胰岛素可能参与睡眠调节，其作用途径考虑为海马CA1区含有胰岛素受体及胰岛素受体底物〔7〕，本研究在海马CA1区内微量注射不同剂量的胰岛素后发现，微量注射0.05 IU的胰岛素对睡眠觉醒周期无影响，而微量注射0.1 IU和0.2 IU的胰岛素能增加大鼠的SWS，减少W，提示胰岛素对睡眠进行调节的靶中枢之一可能是海马，近年本研究室报道作为边缘系统重要组成部分的海马参与睡眠调节支持此观点〔8〕。
　　　
　　1957年，Dement等人创建了多导睡眠图，把睡眠划分为非快眼动相睡眠（NREM）或SWS和快眼动相睡眠（REMS）或PS。 慢波睡眠由浅入深可分为浅睡期和深睡期，深睡期又称为深慢波睡眠。SWS2可显著提高人体的自然免疫机能，促进生长激素的分泌，对机体精力和体力的恢复起着主要的作用，因而睡眠质量的好坏主要取决于SWS特别是SWS2的多少。本研究结果显示海马CA1区微量注射0.1 IU和0.2 IU的胰岛素后，对PS没有影响，主要影响SWS，均能显著增加SWS1。并且当注射剂量为0.2 IU时，在增加SWS1的同时，还能增加SWS2成分，使大鼠睡眠加深。提示胰岛素在海马CA1区具有促眠效应，且胰岛素对大鼠睡眠深度的影响与注射剂量呈正相关。

参考文献

　1 Valatx JL，Douhet P，Bucchini D.Human insulin gene insertion in mice.Effects on the sleepwake cycle〔J〕? J Sleep Res，1999；8(Suppl 1)：658.

　　2 Moosavi M，Naghdi N，Choopani S.Intra CA1 insulin microinjection improves memory consolidation and retrieval〔J〕.Peptides，2007；28:102934.

　　3 BlancoCenturion CA，Shiromani A，Winston E，et al.Effects of hypocretin1 in 192IgGsaporinlesioned rats〔J〕.Eur J Neurosci，2006； 24:20848.

　　4 Simon C，Brandrnberger G，Saini J，et al.Slow oscillations of plasma glucose and insulin secretion rate are amplified during sleep in humans under continuous enteral nutrition〔J〕.Sleep，1994；17:3338.

　　5 蔡益鹏.睡眠的神经内分泌学.见:谢启文，主编.现代神经内分泌学〔M〕.上海:上海医科大学出版社，1999： 40813.

　　6 Tasali E，Leproult R，Ehrmann DA.Slowwave sleep and the risk of type 2 diabetes in humans〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008；105:11078.

　　7 Wang H，Wang R，Zhao Z，et al.Coexistences of insulin signalingrelated proteins and choline acetyltransferase in neurons〔J〕.Brain Res，2009；1249:2373.

　　8 李春华，张 瑾，赵乐章，等.海马中5羟色胺对慢波睡眠的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2006；12:8445.