NShc蛋白功能的研究进展

【关键词】 NShc蛋白；细胞凋亡；神经营养因子

NShc是原癌基因Shc家族中的一员，一般认为它只在成熟的中枢神经系统中表达，在神经细胞的存活中发挥重要作用。NShc在外周神经比如小肠神经系统、以及一些肿瘤细胞中也有表达；它可以通过参与PI3KAkt信号通路的传导抑制细胞凋亡。同时，NShc在肿瘤的发生与发展、在海马突触的可塑性以及在神经退行性疾病的形成等过程中的作用也在不断地被认识。这为神经退行性疾病和肿瘤的防治提供了新的思路。NShc是 Shc家族的新成员，是一种衔接蛋白分子，一般认为它主要传导神经营养因子信号，维持神经细胞的存活，在神经细胞的发展过程中通过抑制细胞凋亡保护神经细胞。最近还发现NShc 对许多肿瘤的发生发展起重要作用，尤其是成神经细胞瘤和甲状腺癌〔1，2〕。本文就NShc蛋白的功能研究进行综述。

　　1 Shc家族结构特点

　　Shc家族包括ShcA、ShcB（又称为Sck/Sli）和ShcC(又称为NShc或Rai)三个基因成员，它们编码6种Shc衔接蛋白分子〔3〕。ShcA 编码3 个分子：p52ShcA、p46ShcA 和p66ShcA；ShcB只编码一个分子p68ShcB；ShcC编码两种蛋白，分别为p64 NShc和p52 NShc〔4～6〕。Shc家族蛋白在结构上都具有特有结构域PTBCH1Sh3，PTB 和Sh3是两个磷酸酪氨酸结合区域，而CH1含有酪氨酸磷酸化位点是Shc蛋白信号输出的区域，而p66ShcA和p64 ShcC在氨基末端含有一个Ch3区域〔3〕。最近又发现了Shc家族的两个新成员ShcD和 RaLP〔2，6〕。

　　2 NShc蛋白的一般分布特点及其神经保护作用
　　
　　一般认为NShc特异性地表达于神经细胞。在早期的神经组织（主要包含神经干细胞和神经祖细胞）中检测不到NShc，此时的神经细胞大量表达ShcA。随着神经系统的发育，神经干细胞/神经祖细胞逐渐分化为成熟的神经细胞，NShc也逐渐取代ShcA在神经细胞中大量表达〔8〕。虽然NShc的表达仅局限于未成年和成年动物的中枢神经系统，但NShc在神经系统内的表达水平也不均一，在丘脑内的含量最高，在大鼠海马内也有较高的表达。这种分布特点和NShc的功能相对应，NShc主要起神经保护作用，维持神经元的存活，这在许多基因敲除和基因突变的试验中已被证实；此外，NShc在神经细胞发育过程中促使神经干细胞和神经祖细胞的分化和增殖。
　　
　　2007年Villanacci的研究小组在人类的消化系统和小肠神经系统（enteric nervous system，ENS)检测到了NShc蛋白。他们发现NShc在肠道神经胶质细胞中强阳性表达。这说明NShc并非特异性地表达于中枢神经系统，它在小肠神经系统的发育中也扮演着重要的角色〔9〕。

　　3 与NShc蛋白相关的信号传导机制

　　3.1 NShc与神经营养因子

　　神经营养因子及其受体在胚胎期神经细胞的分化和成熟神经细胞的存活中扮演着核心的角色，主要的神经营养因子包括脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor， BDNF)，神经胶质细胞性营养因子(glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF)，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等，其中BDNF和GDNF是最为重要的神经营养因子〔3，10〕。NTs效应主要通过受体酪氨酸激酶Trks调节，Trks的亚体TrkA、TrkB 和Ret分别是NGF、BDNF 和GDNF的高亲和力受体〔10〕。在中枢神经系统中NShc可以传导BDNFTrkB信号。有人认为NShc通过PI3KAkt通路调节下游信号，当视网膜神经节细胞遭受NMDA 刺激损伤时，NShc 通过PI3K Akt通路增强了BDNF 介导的神经保护功能〔6〕。也有人认为NShc通过Grb2或Crk传导下游信号，但NShc和Grb2亲和力不高，另一个位点结合Crk，具体的分子机制还有待于进一步研究。GDNF主要通过酪氨酸激酶Ret的激活维持神经系统的发育和存活。当神经细胞被低浓度的GDNF刺激时，NShc的神经保护存活效应依赖NShc的磷酸化和Ret的活化。发育中的神经细胞的活化依赖GDNF，GDNF与其相应的受体Trk和Ret结合，活化的受体通过 PI3KAkt和RasMAPK传导通路刺激神经细胞的存活〔11〕。

　　3.2 NShc与PI3KAkt信号通路

　　NShc的神经保护功能主要依靠Ret和TrkB介导的PI3KAkt信号通路。NShc是Ret的生理底物，在培养的神经细胞和突变试验中得到证实〔5〕，PI3KAkt通路对中枢和外周神经的存活都发挥着重要的调节作用，比如实验中发现NGF诱导的颈上神经节的交感神经元的存活主要依赖PI3KAkt通路。依赖Ret 的神经细胞的存活也依赖 PI3KAkt 通路。NShc的过多表达能够促进PI3KAkt 的激活和延长神经细胞的寿命，如果用PI3K抑制物处理神经细胞，NShc的神经保护效应也相应被阻断。以上都说明了NShc通过PI3KAkt传导神经营养因子的神经元存活信号。NShc通过PTB区域和活化的Ret的Tyr1062位点结合，结合后的NShc被磷酸化使得其更容易招募p85，增加了NShc/ p85的稳固性，p85和NShc的Sh3区域结合，Ret/NShc/p85复合物招募PI3KAkt从细胞质转到细胞膜上并激活PI3KAkt，也有报道NShc可以不依赖Ret直接招募p85和PI3KAkt〔5〕。PI3KAkt信号是NShc主要的功能信号通路，通过分析分化过程中的神经干细胞/祖细胞发现，NShc通过PI3KAktBad 信号通路并且活化MAPK信号正向影响这些细胞的分化和成熟〔12〕。当然，NShc作为信号衔接蛋白除了传导Ret介导的信号还传导其他受体信号，比如TrkB介导的脑源性神经营养因子BDNF信号，其他未知信号有待于进一步研究。

　　3.3 NShc与Grb2/SOS Ras信号通路

　　在胚胎期的神经细胞中，募集到受体上的p52/46ShcA被受体酪氨酸激酶激活并招募Grb2/SOS复合物最终导致RasMAPK通路的激活，促使有丝分裂的进行。当神经细胞向成熟细胞转变时，NShc通过招募PI3KAktBad信号蛋白抑制RasMAPK通路信号及有丝分裂反应〔12〕。因为在神经发育过程中，早期以ShcA为主调节神经干细胞/祖细胞的增殖，成熟后的神经细胞以NShc为主维持神经元的存活，所以NShc不传导Grb2/SOS RasMAPK信号或者抑制其传导应该是合理的，磷酸肽基因定位实验发现NShc仅在Y304有一个Grb2结合位点，而ShcA 有两个位点即239/240、317和Grb2结合，这一发现也支持上述推测〔12〕。

　　4 NShc蛋白的异位表达与肿瘤的发展

　　NShc主要在成熟的神经组织中表达，随着研究领域的扩展，发现NShc在一些肿瘤细胞中大量表达并在肿瘤的发展过程中发挥重要的作用。2002年Izumi 研究小组发现大多数的成神经细胞瘤细胞中存在高水平的磷酸化NShc，也有人发现成神经瘤细胞中NShc的水平与其恶性程度成正比〔1，13〕。2005年Valentina研究小组发现甲状腺癌细胞中存在高水平的NShc，并且在起源于甲状腺上皮细胞的乳头状甲状腺癌中也能检测到高水平的NShc〔2〕。

　　4.1 NShc与成神经细胞瘤

　　自从Izumi等〔13〕人发现NShc在成神经细胞瘤中高水平表达后，Shc家族和成神经细胞瘤的关系成为研究的热点。Terui等〔14〕人发现成神经细胞瘤还表达一定水平的ShcA和低水平的ShcB，在Shc家族三个成员中，只有NShc的表达与成神经细胞瘤的进展密切相关；在早期的成神经细胞瘤细胞中检测不到NShc，只有在晚期肿瘤中才能检测到高水平的NShc。所以NShc可以作为成神经细胞瘤评价预后的独立指标。但是为什么NShc的表达与成神经细胞瘤的恶性特征相联系还不是太清楚。在成神经细胞瘤中NShc和ALK 共表达，并且MYCN 基因大量扩增，而MYCN被认为是成神经细胞瘤预后不良的指标，ALK 的C端含有两个潜在的PTB 结合位点(NPNY，aa10931096 和 NPTY，aa15041507)。基于以上发现Izumi认为〔13〕由于MYCN 和ALK基因大量扩增激活了ALK，激活的ALK活化NShc使其高度磷酸化。由此构成ALKNShc信号传导通路，Terui等人的研究〔14〕也证实这一观点，但是还需要更多的临床证据完善这一观点。
　　　
　　NShc在成神经细胞瘤的恶性进展中发挥着重要作用，在成神经细胞瘤细胞的增殖、存活、迁移、转化和耐药性中起着重要作用。Terui发现含有缺乏Grb2结合位点的NShc 的NB39nu 细胞（一种成神经细胞瘤细胞）的存活、分化和运动活力遭到严重破坏，并发生凋亡，ERK 和Akt信号通路在这一过程中发挥着重要作用〔14〕。也有人发现NShc可以不通过NShc/ Grb2通路独立发挥作用，具体机制仍不清楚。Izumi还发现过多表达的NShc通过放大BDNFTrkB信号增强成神经细胞瘤细胞的耐药能力〔13〕。

　　4.2 NShc与甲状腺癌

　　Valentina首次在恶性甲状腺肿瘤中发现了NShc的表达，NShc主要在髓样甲状腺癌和乳头状甲状腺癌中表达，在体外培养细胞和临床肿瘤样本中都得到证实〔10〕。他们还发现NShc在甲状腺恶性肿瘤中与Ret的两个致癌亚体Ret/PTC1或Ret/MEN2A共表达，并且结合成复合物。NShc选择性表达在恶性癌细胞中可能与癌细胞的存活有关，这在成神经细胞瘤中已得到证实。NShc是Ret受体的生理底物，NShc依赖Ret激活发生磷酸化从而激活PI3K信号通路〔5〕。在恶性甲状腺肿瘤中NShc和GAB1组成性表达，但二者的结合机制还不清楚，有人认为NShc通过改变GAB1的构象与其结合。NShc/GAB1的相互作用通过二者的酪氨酸磷酸化而巩固，并且试验中发现GAB1磷酸化增加了Akt的活化，潜在地增强了细胞的存活〔2〕。如果敲除NShc，NShc/GAB1信号的下游PI3K/Akt分子事件和生物活性都相应降低，癌细胞的自发凋亡率明显增加。可见NShc在甲状腺恶性肿瘤的发生和发展中扮演重要的角色，NShc被Ret的致癌亚体Ret/PTC1或Ret/MEN2A激活通过NShc/GAB1PI3KAkt信号通路发挥作用。

　　5 NShc蛋白与海马突触可塑性
　　
　　2005年Miyamoto等〔6〕人发现了NShc的一个新功能，它通过调节大脑海马的NMDA受体的磷酸化水平调节海马突触的可塑性。他们发现NShc基因缺陷的小鼠的空间和非空间学习和记忆的能力明显比对照组要强；与此对应电生理学分析发现NShc基因缺陷小鼠海马的长时程增强（longterm potentiation，LTP）明显增强，抗NMDA受体抗体对NMDA受体抵抗的功能也明显被削弱；还发现NMDA受体亚基NR2A和NR2B的酪氨酸磷酸化水平也明显升高。因为NShc特异性地和NMDA受体的NR2B亚基结合并与NMDA受体以及Src 或Fyn等酪氨酸激酶相互作用，NR2B亚基的酪氨酸位点均可以被Src和 Fyn酪氨酸激酶活化〔15〕。上述研究表明NShc和LTP以及动物的学习记忆能力呈负相关，其中的作用机制Miyamoto认为，在Src/FynNMDANShc复合体中Src/Fyn作为酪氨酸激酶使NMDA受体磷酸化而激活，而NShc则发挥相反的作用使NMDA受体脱磷酸化而失活〔6〕。ShcA/Ras/MAPK通路已经被证明与海马的LTP没有太大相关性，也有人认为NShc通过PLC /IP3/CaMKIV通路调节突触的可塑性，因为PLC /IP3/CaMKIV通路被证实与海马的LTP有很大的相关性〔16〕。

　　6 NShc蛋白与氧化应激和细胞凋亡的关系以及在神经退行性疾病中的功能

　　P66shcA是一直研究比较热的信号衔接蛋白，它是一种氧化应激反应蛋白，通过对细胞内ROS引起的氧化应激反应促进细胞凋亡〔4〕。P66shcA被认为是衰老和心血管疾病共同的最后通路蛋白〔17〕，所以P66shcA现已被作为药物作用的靶点。但成年动物的神经系统并不表达P66shcA，只表达NShc，同样NShc在细胞凋亡中也有着重要角色〔18〕。

　　
　　细胞凋亡在神经系统的生理和病理状态下都发挥重要作用。在神经发育过程中，大批的神经细胞在神经营养因子的诱导下通过凋亡的方式被消除；在成熟神经系统中，许多生化分子或遗传性事件引起神经细胞的凋亡和神经退行性疾病〔19〕。实验研究证实NShc是一种神经特异性的抗应激基因，在培养的神经细胞和脑各区域的细胞中，在包括氧化应激、缺氧、局部缺血等各种应激刺激下，NShc能耐受丝氨酸苏氨酸脱磷酸作用。在同一细胞群中，NShc的过度表达能够使它耐受毒物的刺激，从而提高其生存率，由此NShc的表达可能保护神经细胞免受应激引起的细胞凋亡。Flavia Troglio等发现Rai/小鼠对缺血再灌注损伤较为敏感，他同时发现NShc通过激活PI3KAkt抑制缺血再灌注脑区的细胞凋亡〔20〕。体外实验也表明NShc缺陷的小鼠初级皮层神经元对双氧水和缺氧的耐受能力比较低。限制Ret 的有效配基或者缺少Ret激活的情况下，NShc的过多表达仍可以通过减少凋亡促使神经细胞的存活，虽然NShc的过多表达增强了依赖Ret的PI3K和Akt的活化，但NShc可以不依赖Ret抑制凋亡〔19，20〕。在成神经细胞瘤的研究中发现敲除NShc后，癌细胞的自发凋亡率明显增加，这说明NShc在肿瘤中的过多表达抑制了肿瘤细胞的凋亡。由上可知NShc不论在生理条件下还是在病理或神经肿瘤条件下都可以抑制神经细胞的凋亡，现在普遍认为NShc主要通过激活PI3KAkt通路抑制凋亡，其他的分子逐渐也被发现参与这一过程〔5，6〕。
　　
　　神经退行性疾病包括帕金森氏症(Parkinson′s disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)等。它在AD的发病过程中起着重要作用，这类疾病的共同病理特征是神经细胞内淀粉样前蛋白（amyloid precursor protein，APP)和其副产物β淀粉样蛋白（amyloidβ protein，Aβ）的异常聚积，这种处于病态的神经元进行性损失和功能紊乱，并且Aβ是老年斑的主要成分。虽然至今尚不清楚导致这些疾病的真正原因，但氧化应激、线粒体功能障碍以及能量代谢异常已成为共识的早期病理现象〔21〕。NShc是一种神经应激反应蛋白，能够抵抗氧化应激引起的细胞凋亡，研究发现酪氨酸磷酸化的NShc蛋白和Fe65可以影响APP的形成过程，并且NShc能够降低Aβ的水平，这为治疗AD提供了新的途径〔22〕。

　　7 小结
　　
　　随着对NShc蛋白研究的不断深入，对这一神经信号衔接蛋白的认识也在逐渐地深化。已明确NShc蛋白不只在发育成熟的中枢神经系统中表达，在外周神经系统比如小肠神经系统、以及一些肿瘤细胞中也有表达。目前认为NShc蛋白的主要功能在于对神经细胞的保护作用，NShc蛋白通过参与PI3KAkt信号通路的传导，起到抑制细胞凋亡的作用。同时，NShc蛋白在肿瘤的发生与发展、在海马突触的可塑性以及在神经退行性疾病的形成等过程中的作用也在不断地被认识。NShc蛋白是否还存在其他的功能？NShc蛋白在抑制细胞凋亡、保护神经细胞的过程中是否还存在其他信号传导通路的介导？其具体的分子机制又是如何？这些问题尚有待于进一步研究证明。

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