Aβ142诱导皮层神经元细胞凋亡的机制及通心络的干预作用

作者：张志慧 周

【摘要】 目的 探讨Aβ诱导皮层神经元凋亡的机制及通心络的干预作用。方法 原代培养的小鼠皮层神经，经Aβ142处理后，MTT判断神经元存活率，Hoechst33342染色、流式细胞仪检测检测神经元凋亡，Western印迹法检测caspase凋亡蛋白的表达。结果 神经元经Aβ142处理后，活细胞数减少，染色质浓缩、核碎裂，染色阳性神经元增多，细胞凋亡率上升，caspase3表达增强。通心络可明显改善上述变化。结论 Aβ通过caspase3途径引起神经元凋亡从而导致神经元细胞死亡。通心络可抑制Aβ诱导的神经元凋亡来保护神经元，从而起到治疗AD的作用。

【关键词】 Aβ淀粉样蛋；通心络；神经元凋亡；caspase3；凋亡相关基因蛋白

　　【Abstract】Objective To study the mechanism ofβamyloid (Aβ) on neuron apoptosis and the effect of Tongxinluo. Methods The neuron survival， apoptosis of neurons were detected by Hoechst 33 342 staining， the expression pf caspase3 was determined by Western blot. Results The number of viable cells was decreased and the condensation of chromatin and nuclear fragmentation were shown after Aβ142 treatment. The expression of caspase3 was elevated after treated with Tongxinluo， all the above indexes were improved. Conclusions The mechanism of Aβ142 inducing neuron apoptosis is related to its regulation on the expression of apoptosisassociated gene and the caspase3 pathway. Tongxinluo could attenuate the neurotoxic action of Aβ142 and improve neuron survival.
　　
　　【Key words】βamyloid protein; Tongxinluo;
Neuron apoptosis; Caspase3; Apoptosisassociated gene

　　阿尔茨海默病(AD)归属于祖国医学中“呆症”和“健忘”等范畴。笔者认为AD病机关键在于肾元亏虚，痰瘀阻络，脑络不通，脑神失用。其中肾元亏虚为发病之本，痰瘀阻络为本病发展和加重的重要病理因素。针对此病机，治疗应当益气、活血、通络。通心络由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片组成，具有益气活血、通络活络功效。方中人参补益元气，元气充足，络气畅通，气旺血行；虫类药活血、化瘀、通络；酸枣仁养血安神，冰片引药入络；诸药合用，达到气旺血行，脑络通畅，诸症自愈。在以往研究中发现，通心络临床治疗40例AD，总有效率达98.3%〔1〕，并可对抗Aβ2335的神经毒性作用〔2〕，具体机制不详。本研究采用Aβ142诱导原代神经元凋亡建立AD细胞模型，观察通心络对Aβ142诱导的神经元凋亡的保护作用，探索AD发病机制及其药物治疗方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　通心络(石家庄以岭药业股份有限公司，批号：070901)，Aβ142(国家疾病预防与控制中心病毒学研究所合成馈赠)，CO2培养箱、DydatechMR 4000型酶标仪、胎牛血清(Sigma公司)，培养基、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma)，二甲基亚砜(DMSO， Sigma)，caspase3抗体（Santa Cruz)等。

　　1.2 皮层原代神经元培养

　　取怀孕14～16 d昆明小鼠，75%乙醇浸泡消毒皮肤，取出胎鼠，无菌条件下断头取全脑，用眼科镊仔细剥除脑膜，切下双侧大脑皮层，剪碎，移入消化液中（0.125% 胰酶，用0.01 mol/L PBS配制），置37℃水浴箱中消化20 min，每隔5～10 min取出摇匀。待组织块下沉后，用巴氏滴管吸出上清液，加入含10%FBS（胎牛血清）的DMEM完全培养基 2～3 ml，静置5 min终止胰酶消化。弃上清，将组织悬浮于完全培养基中，用尖端经火焰钝化的巴氏滴管缓慢吹打20～30次，待组织团块基本消失，静置数分钟，将上层细胞悬液经100目不锈钢网过滤，残余组织再加入含10％FBS的DMEM／F12反复吹打，静置，悬液过滤。收集两次过滤的单细胞悬液进行计数，台盼蓝拒染法计数细胞活力。用含10％FBS的DMEM／F12（临用前添加L谷氨酰胺20 μmol/L，葡萄糖3 g/L）调整活细胞密度为1×106/L，接种于1％L多聚赖氨酸预包被的6孔或96孔培养板，每孔2 ml，在37℃， 5% CO2，95%空气及饱和湿度的细胞培养箱中孵育24 h。细胞贴壁后，更换新鲜的含20% B27的无血清DMEM／F12，抑制胶质细胞的增殖。此后每隔3 d换半液，培养至7～10 d的神经细胞经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学(SABC法)鉴定，神经元占95%以上。细胞生长至7～10 d可用于药物干预试验。

　　1.3 淀粉样蛋白的老化处理

　　将1 mg Aβ142溶解在1 ml的DMEM培养基中，置于37℃孵箱中孵育7 d，使蛋白凝聚，然后-20℃贮存备用。

　　1.4 Aβ142损伤神经元的量效关系

　　将上述神经元细胞种植在96孔培养板中，待细胞生长状态良好时加入含不同浓度Aβ142的DMEM培养液，100 μl／孔。第1组细胞的处理：细胞长至亚融合状态时更换培养基并加入Aβ142，终浓度依次为10、20、40、80、160 μmol／L，培养24 h，以不加Aβ142的细胞为阴性对照。第2组细胞的处理：细胞长至亚融合状态时更换培养基并加入Aβ142(终浓度为40 μmol／L)，于培养12、24、36、48 h终止培养，以不加Aβ142的细胞为阴性对照。终浓度为40 mol/L作用24 h适合建立细胞损伤模型。

　　1.5 分组及药物处理

　　神经元细胞以106/ml密度接种于6孔板，实验分为①正常组：用5% FBS的DMEM培养基培养24 h后进行检测；②模型组：细胞培养后，加入终浓度为40 μmol/L Aβ142作用24 h诱导细胞损伤；③通心络组：细胞培养后，在加入 Aβ前，分别加入终浓度为200、100、50 μmol/L的通心络预处理4 h，再加入终浓度为40 μmol/L Aβ142作用24 h诱导细胞损伤。

　　1.6 细胞的形态学观察

　　在倒置显微镜观察经各因素处理后神经元的形态学变化。

　　1.7 MTT法检测细胞存活率

　　细胞经上法处理后，吸去上清液，在无菌条件下每孔加入5 mg/ml MTT 100 μl，继续培养4 h，小心吸取培养液保存，每孔加入200 μl的DMSO溶液，反复振荡30 min，直至MTT反应的蓝色结晶产物完全溶解。用酶标仪检测490 nm和630 nm波长处每孔样品的吸光度值。

　　1.8 细胞凋亡的观察及测定

　　实验结束后，收集细胞，Hoechst33342染色，置于免疫荧光显微镜下观察。实验结束后收集细胞，75%乙醇固定过夜，上流式细胞仪检测各组神经元细胞的凋亡率。Western印迹法检测caspase3蛋白酶的表达。

　　1.9 统计学处理

　　实验数据用x±s表示，采用SPSS16.0统计软件，两组比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　正常组皮质神经元培养7 d后，胞体呈梭形或三角形，聚堆生长，相互交织成网状，折光性好。Aβ142损伤模型组细胞损伤严重。通心络各组均有改善，以大剂量为著（见图1）。

　　2.2 对原代神经元细胞存活率的MTT检测

　　模型组与空白组原代神经元细胞存活率有显著差异(P<0.05)，100、200 μmol/L两个浓度组的通心络可提高原代神经元细胞存活率(P<0.05)（见表1）。

　　2.3 Hoechst33342染色（荧光显微镜下观察）结果

　　正常组皮质神经元呈低蓝染色，胞核和胞膜完整，Aβ142损伤模型组细胞损伤严重，细胞呈亮蓝染色，有些细胞呈典型的凋亡形态。通心络各组均有改善，以大剂量为著（图2）。表1 通心络对Aβ142原代神经元细胞存活率的影响（略）

　　2.4 流式细胞仪检测凋亡率结果

　　与正常组神经元凋亡率〔(7.31±0.83)%〕相比，模型组〔(15.34±0.25)%〕显著增高（P<0.01），50、100、200 μmol/L通心络组〔(9.21±0.78)%、(10.01±0.44)%、(11.03±0.22)%〕可降低神经元的凋亡（P<0.01，P<0.05）。

　　2.5 凋亡蛋白caspase3表达比较

　　与正常组比较，模型组神经元中凋亡蛋白酶caspase3显著增强（P<0.01），通心络组caspase3的表达不同程度减弱（P<0.01，P<0.05）（见图3）。

　　3 讨 论

　　AD为一种退行性中枢神经系统疾病，在AD发病过程，细胞凋亡起主要作用〔3〕。脑神经元对凋亡损伤极其敏感，凋亡可能是AD脑中神经元死亡的机制之一，Aβ是各种原因诱发AD共同通路，同时也是凋亡过程的诱导因素之一〔4〕。

　　大量事实证明凋亡发生是一个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。该家族成员caspase3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，Aβ引起caspase3的表达升高，说明可经过caspase3蛋白酶途径引起神经元凋亡〔5〕。
　　
　　本研究中用凝聚的Aβ142片段诱导体外培养的原代神经元细胞，可使细胞存活率下降，而通心络可使神经元活细胞数明显升高，表明通心络对Aβ神经毒具有保护作用。凋亡指标的观察结果表明，Aβ可以引起神经元细胞凋亡，造成凋亡相关蛋白酶上升；而通心络组有不同程度的改善，表明通心络提高神经元存活率，可通过减轻Aβ引起的caspase3的表达，从而起到降低神经元凋亡来实现。因此，在Aβ损伤前用通心络预处理可有效阻止神经元细胞损伤的发生，这为AD的治疗提供了新的药物和治疗方法。

参考文献

　　1 张原莉，刘颖芳，李秀敏. 通心络治疗老年性痴呆40例观察〔J〕.山东医药，2002；42（31）：11.

　　2 冯凯，王晓明，孟晓梅，等.通心络对体外培养SH_SY5Y细胞Aβ2535毒性损伤的保护作用〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志，2007；14(2):902.

　　3 Deshpande A，Mina E，Glabe C，et al.Different conformations of amyloid β induce neurotoxicity by distinct mechanisms in human cortical neurons〔J〕. J Neurosci，2006；26(22)：60118.

　　4 Veereshwarayya V，Kumar P，Rosen KM，et al.Differential effects of mitochondrial heat shock protein 60 and related molecular chaperones to prevent intracellular βamyloidinduced inhibition of complexⅣand limit apoptosis〔J〕. J Biol Chem，2006；281(40):2946878.

　　5 姚明忠，赵伟康.Aβ诱导海马神经元凋亡的机制及补肾方的调控作用〔J〕.中国老年学杂志，2001；21：450.

龙岗 王玲玲 葛小丽 魏聪