2型糖尿病患者外周血血细胞膜表面组织因子的表达及活性的研究

　　　　 作者：黄细莲 钱申贤 刘利蓉 谭俊峰 施鹏飞 高大泉 谢亚萍 黄细莲

【关键词】 糖尿病；组织因子；血栓形成；单核细胞；血小板

2型糖尿病（T2DM）患者有血栓形成倾向，在血管病变的形成和发展中起着相当重要的作用。新近研究表明，血栓性疾病不仅在组织水平，而且在细胞水平已处于高凝状态〔1〕，组织因子（TF）是凝血过程的始动因子，以往认为主要来源于血管内皮，而现在发现外周血细胞中单核细胞能自身合成的TF，血小板亦含有TF〔2〕，后两种细胞含有的TF在T2DM患者血栓形成中的作用，目前国内外研究不多。本文检测了T2DM患者外周血单核细胞和血小板膜表面TF表达情况及活性，探讨其在DM发病机制中的作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象

　　按WHO DM诊断标准〔3〕确诊的T2DM患者42例，男26例，女16例，年龄55～78〔平均（61.12±10.41）〕岁。根据白蛋白排泄率将其分为单纯性DM组（DM组，22例）和DM合并微血管病变组（DN组，20例）。正常对照22例，男性12例，女性10例，年龄56～77岁〔平均（63.52±11.21）〕岁，排除了血栓性疾病及抽血2 w前使用过阿司匹林、肝素等抗凝药物者。

　　1.2 方法

　　流式细胞仪型号:FACS Calibur，美国 BectonDickinson 公司，CD62PPE-Cy5、CD61-PE、CD14PE以及同型对照IgG2a均购自BD Pharmingen公司。TFFITC 同型对照IgG1及Spectrozyme FXa购自American Diagnostica Inc。因子Ⅶa和因子Ⅹ购自上海船夫生物科技有限公司。①标本准备 单核细胞荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血100 μl及CD14PE、TFFITC单克隆抗体10 μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20 min，加入FACS Lysing Solution(1×)溶血素2 ml，混匀后室温暗处反应6～10 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清液；加生理盐水2 ml，低速涡流混匀后1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加1%多聚甲醛液500 μl，低速涡流混匀后上机检测。血小板荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血5 μl及TF FITC、CD62PPECy5、CD61PE单克隆抗体各10 μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20 min，加1%多聚甲醛液500 μl，低速涡流混匀避光保存30 min以上，24 h内上机检测。②单核细胞膜表面TF活性的测定：外周血单个核细胞（MNC）包括单核细胞和淋巴细胞，但淋巴细胞不表达TF，可采用MNC来研究单核细胞TF活性，MNC分离采用密度梯度法，肝素抗凝血经Hank氏液稀释，加入装有淋巴细胞分离液的试管中，2 000 r/min离心30 min，用毛细吸管吸出MNC，显微镜下确定单核细胞百分率，调单核细胞浓度为3×104/ml。根据TF/Ⅶa复合物可以使因子Ⅹ转变为活化因子Ⅹa的原理，利用发色底物Spectrozyme FXa，测定反应体系因子Ⅹa的生成量，判断单核细胞表面TF活性。在体外分离培养的血液单核细胞（2×104/孔），用HEPES缓冲液〔含CaCl2(5 mmol/L)0.1%BSA〕洗涤细胞2次，分别加入因子Ⅶa (100 pmol/L)和因子X（135 nmol/L），37℃孵育30 min，最后在反应体系中加入Spectrozyme FXa（0.5 mmol/L）底物，以405 nm波长测定反应物的吸光度，换算成FXa生成量（nmol/L）。FXa的生成量与单核细胞表面TF活性成正比。血小板膜表面TF活性的测定：外周血用ACD抗凝，经1 000 r/min离心10 min获得富血小板血浆，用PBS调血小板浓度为2×109/ml，利用发色底物法测定FXa生成，方法同上。

　　1.3 统计学分析

　　数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达

　　正常对照组血小板膜表面CD62P、TF阳性表达率及单核细胞膜表面TF表达率很低，而DM患者均明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表1。表1 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达（略)

　　2.2 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性

　　正常对照组血小板及单核细胞膜表面TF活性很低，而DM组较正常对照明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表2。表2 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性（略)

　　2.3 血小板膜表面TF与CD62P表达相关分析

　　TF的表达与CD62P表达呈明显正相关（r=0.685，P＜0.001），提示二者变化是一致的。

　　3 讨 论
　　
　　T2DM患者血栓形成的倾向在各个环节均有体现〔4〕，主要有血管内皮细胞的损害、血小板的激活、凝血纤溶系统的异常和血液流变学的改变，这些变化在伴有血管病变者更明显，提示两者之间存在密切联系，TF是凝血的启动因子，亦在病理血栓形成中发挥关键作用。既往研究认为TF主要由血管内皮细胞受损后产生，而新近的研究发现，一些血细胞成分：如单核细胞、血小板亦能在活化状态下释放TF参与凝血过程〔5〕，在血栓性疾病中（包括DM）血小板含有TF蛋白水平较正常人高〔6〕，这提示在DM患者中，单核细胞、血小板不仅可以通过已知的方式（如单核细胞释放CD14、血小板黏附聚集释放凝血因子）参与病理血栓形成，还可能以释放TF而独立启动凝血过程及血栓形成。
　　
　　基于一系列血细胞如单核细胞、血小板、中性粒细胞上TF的发现，人们提出了细胞水平的止血模式〔5〕，该模式认为凝血途径可不依赖于血管内皮细胞释放的TF来启动，在一定条件下这些血细胞释放的TF亦可独立启动凝血过程。这一模式是经典凝血途径的补充。由于在正常情况下，血细胞如单核细胞、血小板是处于静息状态，不释放TF，只有在病理情况下单核细胞、血小板活化，TF才可释放出来，故血细胞来源的TF在血栓性疾病中的意义可能更大。
　　
　　TF与DM发病紧密相关，DM血管病变者患者外周血单个核细胞中TF mRNA水平、TF 活性及外周血TF蛋白水平较单纯DM患者明显增高，并有研究认为血浆中可溶性TF水平是DM合并血管病变患者疾病进展的一个标志〔7〕。本研究在国内首次采用流式细胞术检测了DM患者体内血小板、 单核细胞膜表面TF的表达及活性，证实DM患者较正常对照明显增高，而DM合并血管病变者增高更明显，并且血小板膜表面TF的表达与血小板活化标志物CD62P表达成正比。这提示DM患者血细胞释放的TF亦可能参与了其发病过程中高凝状态的形成及病理血栓的生成。研究表明，DM患者体内高血糖，高胰岛素血症、高渗透压可激活体内单核细胞和血小板〔8〕，并能促进单核细胞合成及释放TF，而单核细胞又可以含TF微粒的形式将TF传递给血小板，后者摄取后可将TF贮存至ａ颗粒中，活化时可将其释放出来；血小板的活化又可进一步促进单核细胞TF活性，它们之间的作用主要是通过血小板膜CD62P介导的，这种相互作用，互为影响可形成恶性循环，促进血栓形成。

参考文献

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