激活的ACM对鱼藤酮诱导的细胞氧化损伤的抑制作用

　　　　　　作者：刘辉 尹芳秋 高秋菊 郭魁亮 陈盛鹏 刘杰 贺森

【摘要】 目的 观察激活的星形胶质细胞条件培养液(ACM)在鱼藤酮所致PC12细胞氧化损伤过程中的作用。方法 收集激活的ACM，加入到鱼藤酮染毒PC12细胞中，观察其对染毒神经元胞内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性的影响，并检测细胞活性氧(ROS)水平和线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性变化。结果 ACM可明显降低染毒PC12细胞MDA和ROS水平;与完全培养基处理比较，ACM能有效增加染毒神经元SOD和GSHPx的合成和释放，保护和提高抗氧化酶活性。结论 ACM能有效抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞氧化损伤。

【关键词】 星形胶质细胞条件培养液;鱼藤酮;氧化损伤

研究发现，长期接触农药鱼藤酮是引起帕金森病(PD)等神经退行性疾病的重要环境诱发因素之一〔1〕。鱼藤酮属线粒体抑制类农药，由其引发的线粒体功能障碍及氧化应激与多巴胺能神经元受损密切相关〔2〕，而线粒体功能障碍主要原因是复合物Ⅰ活性被抑制。星形胶质细胞是体内产生神经营养因子的主要细胞，激活的星形胶质细胞条件培养液(ACM)中含有神经生长因子和胶质源性神经营养因子等多种神经营养成分〔3〕。本研究应用睫状神经营养因子(CNTF)激活星形胶质细胞，收集ACM处理正常及不同浓度鱼藤酮染毒的PC12细胞，观察ACM对鱼藤酮诱导的神经元氧化损伤的保护作用，为阐明星形胶质细胞在神经退变过程中的作用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器 鱼藤酮(纯度97.6%)、DCFDA购自Sigma公司，DMEM/F12培养基购自Gibco公司，睫状神经营养因子购自Peprotech公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;MPF4荧光分光光度计购自Hitach公司，激光共聚焦显微镜购自Leica公司。

　　1.2 星形胶质细胞培养及ACM收集 SD新生大鼠断头取中脑组织，按照McCarthy〔4〕所述方法分离和纯化星形胶质细胞，经3次传代后常规免疫组化GFAP染色鉴定。用含有CNTF(40 ng/ml)的DMEM/F12无血清培养基孵育12 h，收集培养液，4℃，4 000 r/min离心5 min，取上清即获得ACM。

　　1.3 染毒PC12细胞内MDA、SOD和GSHPx活性测定 PC12细胞接种于12孔板中，于对数生长期加入鱼藤酮工作液处理，随机分成对照组、0.1、0.5、1.0 μmol/L鱼藤酮组，各实验组分别用完全培养基和ACM进行处理，继续培养24 h后，按试剂盒说明书操作进行活性检测。

　　1.4 染毒PC12细胞线粒体活性氧簇(ROS)的检测 PC12细胞干预和分组同上，用100 μmol/L DCFDA避光孵育30 min，经PBS漂洗后，激光共聚焦显微镜记录各孔荧光强度(激发波长485 nm，发射波长530 nm)，荧光强度与ROS水平成正比，增加的荧光强度即被认为是增加的活性氧。

　　1.5 染毒PC12细胞线粒体复合物Ⅰ活性的检测 PC12细胞干预和分组同上，将处理后的细胞用预冷的PBS漂洗2次，此后加入预冷的8 mg/ml毛地黄皂苷溶液，冰浴10 min，以10 000 r/min，4℃，离心5 min，弃上清，立即用100 μl氨基乙酸缓冲液溶解，再加入10%十二烷基麦芽苷溶液20 μl，冰浴5 min，以20 000 r/min，4℃，离心30 min，上清液蛋白质定量后取样品10 μl进行线粒体复合物Ⅰ活性测定〔5〕，重复5次，取平均值。

　　1.6 统计学处理 实验数据用x±s表示，采用SPSS11.0软件进行组间t检验。

　　2 结 果

　　2.1 星形胶质细胞的培养、纯化和鉴定 分离培养并纯化的星形胶质细胞经GFAP免疫组化染色发现，培养至第三代的星形胶质细胞纯度可达95%以上，符合实验设计需求。

　　2.2 ACM对染毒PC12细胞内MDA、SOD和GSHPx活性的影响 用完全培养基处理的染毒PC12细胞内MDA含量显著增加，SOD和GSHPx活性随染毒剂量的增大而随之下降。与完全培养基处理比较，ACM培养染毒神经元后，各实验组MDA含量明显下降(P<0.01);0.1和0.5 μmol/L鱼藤酮组SOD和GSHPx活性显著升高(P<0.05)，见表1。

　　2.3 ACM对染毒PC12细胞ROS水平的影响 完全培养基处理的染毒PC12细胞ROS荧光强度明显增强，而与之比较，ACM培养的0.5和1.0 μmol/L 鱼藤酮组PC12细胞ROS平均荧光强度显著降低(P<0.05)，见表2。

　　2.4 ACM对染毒PC12细胞线粒体复合物Ⅰ活性的影响 线粒体复合物Ⅰ活性随染毒剂量的增大明显降低。与完全培养基处理比较，ACM培养染毒神经元后，各实验组线粒体复合物Ⅰ活性增强，但差异不显著，见表2。表1 ACM对染毒PC12细胞MDA、SOD和GSHPx活性的影响与完全培养基组比较:1)P<0.05，2)P<0.01;下表同表2 ACM对染毒PC12细胞ROS和复合物Ⅰ活性的影响

　　3 讨 论

　　PD是一种中老年人常见的进行性神经系统退行性疾病，其主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元显著缺失，从而导致纹状体多巴胺含量降低〔6〕，但其确切发病机制尚不完全清楚。近年来的研究表明，活性氧和氧化应激在神经元退变中起着重要作用〔7〕。鱼藤酮抑制线粒体复合物Ⅰ活性，引起线粒体活性氧簇(ROS)水平升高，进一步加重机体氧化损伤。而线粒体是细胞对氧化应激最敏感的细胞器，自由基又可造成线粒体损伤，如此形成恶性循环，最终导致细胞死亡。

　　本实验发现，鱼藤酮染毒PC12细胞线粒体复合物Ⅰ活性显著降低，ROS水平则高于正常对照组。表明鱼藤酮通过阻抑复合物Ⅰ的电子传递，造成电子逃逸并与细胞内O2反应生成O2，后者进一步在细胞内代谢生成h3O2和OH-，引起细胞氧化应激反应。经ACM处理PC12细胞后，0.5和1.0 μmol/L 鱼藤酮组细胞ROS水平明显降低，而线粒体复合物Ⅰ活性未显著增强。表明ACM并未明显改善染毒神经元线粒体复合物Ⅰ的抑制水平，但可能含有清除活性氧的抗氧化剂、抗氧化酶成分，或者ACM中某种或某些成分能诱导神经元细胞内抗氧化酶基因的表达。

　　MDA是脂质过氧化的产物，其含量高低反映机体内脂质过氧化的程度。GSHPx属于清除自由基的酶促防御系统，是细胞抗氧化酶系统中的主要成员。SOD对维持机体氧化与抗氧化的平衡起到至关重要的作用，它能迅速清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，其活力大小反映了细胞抗氧化损伤的能力。本实验结果显示，鱼藤酮染毒PC12细胞SOD和GSHPx活力均显著降低，清除自由基能力下降，进而导致生物膜中的多不饱和脂肪酸过氧化反应和脂质过氧化的产物MDA含量增加，引起细胞损伤。然而，经ACM处理PC12细胞后，0.1和0.5 μmol/L鱼藤酮组SOD和GSHPx活性显著升高，各实验组MDA含量明显下降。进一步证实星形胶质细胞通过分泌细胞因子、过氧化氢酶和还原型谷胱甘肽(GSH)等多种蛋白质，为周围神经元提供合成GSH的前体物质，防止氧化应激导致的细胞死亡。

　　近年来，星形胶质细胞在神经退变性疾病中的作用日益受到人们的重视。有学者认为，在病理条件下，功能改变的星形胶质细胞可能是PD等神经退行性疾病发生、发展的始动因素或促进因素〔8〕。星形胶质细胞表现出一定的抗氧化功能，但激活的星形胶质细胞亦能分泌大量的NO及其他有毒物质，刺激活性氧的生成，对神经元生存起毒性作用。因此，设法促进星形胶质细胞的保护功能，抑制其对中枢神经系统的不利影响，是今后的研究方向之一。

参考文献

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　　2 Claudia MT，Todd B，Sherer J，et al.Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures〔J〕. Mol Brain Res，2005;134(6)：10918.

　　3 严稽文，黄其林.星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的保护作用〔J〕.神经解剖学杂志，2007;23(3)：27782.

　　4 Mc Carthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue〔J〕.J Cell Biol，1980;85(3)：890902.

　　5 Mazzio EA，Soliman KF.Effects of enhancing mitochondrial oxidative phosphorylation with reducingequivalents and ubiquinone on 1methyl4phenylpyridinium toxicity and complex IIV damage in neuroblastoma cells〔J〕.Biochem Pharmacol，2004;67(6)：116784.

　　6 董兆君.鱼藤酮的多巴胺神经元毒性和帕金森病〔J〕.国外医学·神经病学与神经外科学杂志，2001;28(5)：35760.

　　7 Nicholls DG.Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal cultures〔J〕.Curr Mol Med，2004;4(2)：14977.

　　8 Fukui H，Moraes CT.The mitochondrial impairment，oxidative stress and neurodegeneration connection：reality or just an attractive hypothesis〔J〕? Trends Neurosci，2008;31(5)：2516.