大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

　　　　 作者：魏爱宣 李昕华 闫世军 何金婷 莽靖 邢影 邵延坤 徐忠信

【摘要】 目的 原代培养和鉴定大鼠皮层星形胶质细胞，并建立大鼠皮层星形胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型。方法 大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧DHank液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。结果 星形胶质细胞培养至第9天， GFAP染色阳性细胞为98.54%±2.01%;星形胶质细胞经不同时间OGD处理后，台盼蓝染色呈现不同形态;OGD60 min时，星形胶质细胞LDH漏出率较对照组明显增加(P<0.05)，并随时间递增。结论 成功完成大鼠皮层星形胶质细胞原代培养，星形胶质细胞在培养第9天可用于模型制备，成功建立星形胶质细胞OGD模型。

【关键词】 星形胶质细胞;原代培养;氧糖剥夺(OGD)

　　【Abstract】 Objective To conduct primary culture and identification of rat cerebral cortical astrocytes， and to set up the oxygen/glucose deprivation (OGD) model. Methods Cells presented in the culture were shown to be astrocytes after characterization by immunocytochemistry， using specific antiGFAP antibody. OGD model was established with hypoxic DHank′s and anaerobic chamber and identified by cell death and LDH release rate. Results Immunohistochemistry of cultured cell showed that the positive rates of GFAP were 98.54%±2.01% at the 9th day; different shape and motility identified by trypanblue stain was observed when exposed to different OGD time; 60 min OGD caused a significant increase on the levels of LDH release (P<0.05). Conclusions The primary culture astrocytes could be explored to OGD at the 9th day. The model of OGD ischemia in astrocytes is successfully established by hypoxic DHank′s and an anaerobic chamber.

　　【Key words】 Astrocytes; Primary culture; Oxygen glucose deprivation (OGD)

　　研究表明在缺血缺氧性脑损伤过程中，星形胶质细胞和神经元有着动态、复杂的相互作用，从而维持脑组织的正常功能和存活〔1～3〕。本实验采用大鼠皮层星形胶质细胞原代培养，应用体外氧糖剥夺(oxygenglucose deprivation， OGD)建立大鼠脑皮层星形胶质细胞缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程，为今后进一步探讨缺血过程中星形胶质细胞的脑保护作用机制奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 出生1～2 d内的Wistar乳鼠，用于星形胶质细胞原代培养。购自吉林大学动物实验中心。

　　1.2 大鼠皮层星形胶质细胞原代培养 采用酶消化法和机械分离法相结合培养星形胶质细胞。Wistar乳鼠分离出皮层组织，清洗后剪碎成0.5 mm3的小块，移入无菌锥底离心管内，加入胰酶，形成细胞悬液;于37℃，5% CO2培养箱中孵育、培养、传代备用。

　　1.3 大鼠皮层星形胶质细胞鉴定 ①细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。②星形胶质细胞在培养第9天用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200×视野，计数，取均值，计算阳性细胞百分比。

　　1.4 体外培养星形胶质细胞OGD模型的建立 ①利用自行设计、长春应用化学研究所生产的组装瓶和负压吸引装置将DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧气体，制备缺氧DHank液，用血气分析仪测定缺氧DHank液的氧浓度。②将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪测定缺氧罐内氧含量。③将培养第9天的星形胶质细胞用缺氧DHank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时;分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120、180 min再复氧24 h的星形胶质细胞进行评价。

　　1.5 体外培养星形胶质细胞OGD模型的评价 ①台盼蓝染色法测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔，吸弃上清液，然后加一滴 0.4%台盼蓝溶液，在3 min内随机计数200个细胞中蓝染的死细胞及未蓝染活细胞的细胞数，计算细胞死亡率。②LDH漏出率的检测。将待测细胞培养板

　　取出，每组每个时间点取3孔，吸取各孔内的培养液入相应试管内，加入等量PBS 液，制备成细胞匀浆液，收集入相应的试管内。每孔液体设2个试管，分别测定细胞培养液和细胞匀浆液的OD值。按公式计算LDH漏出率。

　　1.6 统计学分析 数据以x±s表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠皮层星形胶质细胞原代培养及细胞鉴定 星形胶质细胞在培养第9天分化成熟，形成密集的神经细胞网络，可见胞体较大、扁平、形状多样、折光性低。GFAP免疫细胞化学染色，可见大部分细胞染成棕黄色，形态多样，胞核圆形或椭圆形，常偏于胞体一侧，胞突较多、较长，彼此交织成网状，阳性细胞占全部细胞的98.54%±2.01%，见图1。

　　2.2 缺氧DHank液体氧浓度及缺氧罐氧含量 缺氧DHank液体的氧浓度低于1%，缺氧罐内氧含量为1%±0.1%，二氧化碳浓度为5%±0.1%。

　　2.3 星形胶质细胞不同OGD时间细胞死亡率及LDH漏出率 星形胶质细胞OGD 15～180 min均未能对细胞形态和活性产生明显影响，90 min后可见少量蓝染细胞，180 min时，蓝染星形胶质细胞增多。随OGD时间增加，星形胶质细胞LDH漏出率逐渐增加，其中60 min时开始明显增加。见表1。表1 星形胶质细胞不同OGD时间细胞死亡率及LDH漏出率

　　3 讨 论

　　体外细胞培养是神经科学研究中一种重要的方法，被广泛应用于神经细胞分子生物学研究。本研究采用酶消化法和机械分离法相结合成功进行体外星形胶质细胞原代培养。通过GFAP免疫细胞化学染色方法对体外原代培养的星形胶质细胞进行了鉴定。GFAP是脑间质纤维的主要亚单位，是星形胶质细胞的特异性标志蛋白， 在星形细胞中有丰富而唯一的表达。本实验培养出高纯度及发育成熟的神经细胞为完成后续实验奠定了良好的基础。

　　缺血缺氧性脑损伤模型报道较多，方法及实际操作不尽相同〔4，5〕，但体内实验模型难免受到体液、循环等复杂因素的影响，很难解释某单一因素的影响作用及强度。本实验处理的缺氧细胞培养液，液体氧浓度<1%，将真空干燥器制成缺氧罐，罐内O2含量<1%，CO2浓度为5%，台盼蓝染色显示OGD 90 min时可见星形胶质细胞少许蓝染，180 min时，蓝染的星形胶质细胞增多，随OGD时间增加，星形胶质细胞LDH漏出率逐渐增加。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，具有多方面的功能。研究证实，脑缺血时星形胶质细胞活跃，对缺血性脑损伤的发展和转归具有重要意义〔6〕。本实验采用的OGD方法成功地模拟体内脑缺血过程，为研究星形胶质细胞在缺血缺氧性脑损伤中的作用提供了实用、可靠的方法和手段。

参考文献

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　　2 Dienel GA， Hertz L. Astrocytic contributions to bioenergetics of cerebral ischemia〔J〕. Glia，2005; 50(13): 36288.

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