钙调素蛋白磷酸酶对Slingshot1L的调控作用

　　　　 作者：王杨 王岩 赵建武 高忠礼

【摘要】 目的 探讨钙调素依赖蛋白激酶(Calcinenurin/PP2B/CnA/Cn)对Slingshot1L(SSH1L)活性的调控作用。方法 用脂质体法将含YFPSSH1L的重组质粒转染至MG63细胞，经钙离子载体A23187诱导10 min，进行免疫细胞化学染色，观察细胞形态变化;体内及体外实验检测PP3B对SSH1L的活性调控作用;应用免疫共沉实验检测PP2B与SSH1L的相互结合情况。结果 Ca2+信号诱导骨肉瘤细胞形成伪叶，同时SSH1L与Factin移位共聚集至细胞膜伪叶，但是被PP2B有效抑制剂Cypermethrin完全阻断;在体外，SSH1L磷酸酶活性测定实验以及SSH1L与PP2B结合实验证实SSH1L与PP2B在细胞内是一对相互结合的蛋白质，同时PP2B具有促进SSH1L酶活性的作用。结论 PP2B通路对细胞伪叶的形成及细胞运动具有重要调控作用，同时对SSH1L酶具有促进其活性的作用。

【关键词】 钙调磷蛋白激酶(Calcineurin/PP2B/Cna/Cn);Slingshot1L(SSH1L);骨肉瘤

　　【Abstract】 Objective To explore the regulation of calcineurin(PP2B/CnA/Cn) on Slingshot1L(SSH1L)activity. Methods Recombinant plasmids containing YFPSSH1L were transfected to cell MG63 through liposome method and incubated for 10 min via calcium ionophore A23187. The changes in modality were observed by immunocytochemical staining. The regulation of PP2B on SSH1L activity was tested in vivo and in vitro and the interaction between them was further examined by coimmunoprecipitation. Results Ca2+ signal induced osteosarcoma cell to form lamellipodia， where SSH1L and Factin moved together， but were entirely blocked by cypermethrin as the effective inhibitor. SSH1L and PP2B were conjugated proteins in cells; furthermore， PP2B promoted the enzyme activity of SSH1L. Conclusions PP2B pathway can regulation cell motility and lamellipodia production， and promote the activity of SSH1L.

　　【Key words】 Calcineurin(PP2B/CnA/Cn); Slingshot1L(SSH1L); Osteosarcoma

　 钙(Ca2+)/钙调磷蛋白激酶(Calcineurin/PP2B/Cna/Cn)是目前所知的惟一依赖于Ca2+/钙调素的Ser/Thr磷蛋白磷酸酶。本课题组前期工作已经证明钙(Ca2+)/PP2B通路通过激活下游效应子Slingshot(SSH) 1L，进一步激活其下游的Cofilin〔1〕。但Ca2+/PP2B/SSH/Cofilin通路激活后对细胞生物学行为的影响不明。本研究以人成骨肉瘤MG63细胞为研究对象，着重探讨了上述通路激活对细胞形态的影响及机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人成骨肉瘤MG63细胞为本实验室保存。重组质粒MycSSH1L(WT)、MycSSH1L(S937A S978A/2 SA)以及recombinant cofilinHis6由王岩教授惠赠。脂质体 2000( Invitrogen公司)。高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶和EDTA(Sigma 公司)。A23187，重组活性钙神经素A(Calbiochem)。免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司)。抗cmyc抗体、抗HA抗体(博奥森生物工程有限公司)，Rhodamine Phalloidin抗体、抗人Pcofilin抗体、抗人Cofilin抗体(美国SantaCruz公司)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒(迈晨科技有限公司)。

　　1.2 免疫荧光染色实验 MG63细胞在24孔板内铺片培养，待爬片上的细胞长满50%～60%时，脂质体法转染绿色荧光蛋白标记的SSH1L(YFPSSH1L)质粒。转染24 h后更换无血清培养基3 h，实验组加入终浓度为5 μmol/L的A23187，抑制剂组先用Cypermethrin预处理1 h后再加入终浓度为5 μmol/L 的A23187，37℃孵育10 min。PBS冲洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min。加0.1%Triton X100 30 min，PBS冲洗，血清封闭1 h后加Rhodamine Phalloidin抗体，4℃避光孵育过夜，PBS冲洗，封片，激光扫描共聚焦显微镜(Olympus FV500)镜下观察。

　　1.3 体外SSH1L磷酸酶活性测定实验 MycSSH1L转染至MG63细胞，48 h后，采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒的方法及抗cmyc抗体，对照组为抗IgG抗体。回收MycSSH1L，加入7.5 U/μl重组活性钙神经素A以及6.3 μg/ml CofilinHis6 于 20 μl 反应 buffer (50 mmol/L HEPES，pH 7.4，0.1 mmol/L CaCl2，0.5 mmol/L EDTA，3 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L dithiothreitol，0.5 mg/ml牛血清白蛋白，1 μg/ml leupeptin)中30℃反应2 h。反应产物进行SDSPAGE电泳、转膜、杂交(一抗分别为抗人Pcofilin抗体、抗人Cofilin抗体及抗cmyc 抗体)、ECL显色。

　　1.4 SSH1L与PP2B结合(免疫共沉降)实验 将HACn单独或与MycSSH1L共转染至MG63细胞，48 h后，采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)试剂盒的方法及抗myc抗体进行蛋白质结合反应，对照组为抗IgG抗体。回收MycSSH1L，进行SDSPAGE电泳、转膜、杂交(一抗分别为抗HA抗体、及抗cmyc 抗体)、ECL显色。

　　2 结 果

　　2.1 Ca2+信号诱导骨肉瘤细胞形成伪叶，同时SSH1L与Factin移位共聚集至细胞膜伪叶 为了研究Ca2+/PP2B /SSH/Cofilin通路对细胞形态的影响，本研究将绿色荧光蛋白标记的SSH1L(YFPSSH1L)转染至MG63细胞，经A23187等试剂孵育后进行了免疫荧光染色。LSCM下观察结果显示，经A23187诱导Ca2+/PP2B/SSH/Cofilin通路后细胞形成伪叶，以SSH1L过表达的细胞最为明显。同时，SSH1L与Factin移位共聚集至膜伪叶(图1A)，但是PP2B有效抑制剂Cypermethrin完全阻断了细胞伪叶的形成(图1B)，说明PP2B对调控SSH1L及Factin的膜移位具有重要作用。

　　图1 Ca2+信号诱导致骨肉瘤细胞伪叶形成，

　　SSH1L移位至膜伪叶

　　2.2 PP2B对SSH1L的磷酸酶活性具有促进作用 当用A23187处理MG63细胞10 min，经蛋白印迹实验检测Pcofilin水平，结果显示Pcofilin水平明显降低，而经Cypermethrin预处理后有效阻断了上述作用(图2A)。为进一步验证PP2B对SSH1L的活性调控作用，进行了体外SSH 1L磷酸酶活性测定实验，结果显示PP2B明显的激活了SSH1L的活性(图2B)。

　　图2 PP2B对SSH1L磷酸酶活性的促进作用

　　2.3 SSH1L与PP2B结合实验结果 免疫共沉实验结果显示，SSH1L与PP2B在细胞内是一对相互结合的蛋白质，可能是他们相互结合的必备要素(图3)。

　　图3 SSH1L与PP2B细胞内结合部位的确定

　　3 讨 论

　　PP2B在细胞信号传递过程中妆接受Ca2+的调节，起去磷酸化作用，参与多种细胞功能调节，包括T 淋巴细胞活化，心脏瓣膜的形态发生、血管生成以及神经、肌肉组织的发育等。最近的研究表明Calcineurin可能在肿瘤细胞的转移、肿瘤血管增生方面有着重要的作用〔2～4〕。

　　2002年Niwa等在果蝇的遗传研究中发现了一个新的基因，因为其形态类似弹弓(slingshot)，所以将其命名为Slingshot。SSH在各种组织如脑、甲状腺、心脏、脾脏、肾脏、小肠等广泛表达，其cDNA全长为4 467 bp，编码蛋白磷酸酶。人的SSH磷酸酶由3种基因编码，即hSSH1、hSSH2和hSSH3，每种分为长型和短型(长型以L表示)， Slingshot(SSH)是一种专用的Cofilin磷酸酶，其功能的异常可以导致磷酸化丝切因子(Pcofilin)水平上升。研究表明SSH家族可以通过对Cofilin的去磷酸化在微丝骨架的调节中扮演重要角色〔5〕。

　　本实验证明，Ca2+信号诱导骨肉瘤细胞伪叶形成，同时SSH1L与Factin移位共聚集至膜伪叶，但是被PP2B有效抑制剂Cypermethrin完全阻断。细胞伪叶的形成，是细胞运动的初始阶段，主要由Actin的解聚、再聚合参与调解。说明Ca2+/PP2B /SSH/Cofilin通路对细胞伪叶的形成及细胞运动具有重要的调控作用。为了进一步研究PP2B对SSH1L的调控作用，进行了体外SSH1L磷酸酶活性测定实验以及SSH1L与PP2B结合实验，结果证实SSH1L与PP2B在细胞内是一对相互结合的蛋白质，同时PP2B具有促进SSH1L酶活性的作用。上述结果为研究Ca2+/PP2B /SSH/Cofilin通路调控骨肉瘤细胞侵袭、转移的机制奠定了基础。

参考文献

　　1 Wang Y，Shibasaki F，Mizuno K.Calcium signalinduced cofilin dephosphorylation is medicated by Slingshot via calcineurin〔J〕.Biol Chem，2005;280(126):839.

　　2 van Sant C，Wang G，Anderson MG，et al.Endothelin signaling in osteoblasts;global genome view and implication of the calcineurin/NFAT pathway〔J〕.Mol Cancer Ther，2007;6(1):25361.

　　3 Qin L，Zhao D，Liu X，et al.Down syndrome candidate region 1 isoform 1 mediates angiogenesis through the calcineurinNFAT pathway〔J〕.Mol Cancer Res，2006;4(11):81120.

　　4 MartinezMartinez S，Redondo JM.Inhibitors of the calcineurin/ NFAT pathway 〔J〕.Curr Med Chem，2004;11(8):9971007.

　　5 Niwa R，NagataOhashi K，Takeichi M，et al.Control of actin reorganization by Slingshot，a family of phosphatases that dephosphorylate ADF /cofilin 〔J〕.Cell，2002;108( 2):23346.