己酮可可碱对大鼠心肌损伤的保护作用

　　　　 作者：徐志刚 陈立 王春梅 范 征 宋艳芳 王春艳

【摘要】 目的 探讨己酮可可碱(PTX)对心肌损伤的保护作用及机制。方法 建立心肌缺血再灌注(I/R)模型，采用Langendorff灌流装置。120只Wistar大鼠随机分为正常组、缺血组、I/R 5、10、20、30 min组，相应的PTX(100 μmol/L)治疗组，持续观察PTX对血流动力学指标的影响。ELISA法检测心肌组织中的肿瘤坏死因子α(TNFα)含量。 结果 缺血前及灌注期PTX 100 μmol/L给药能明显恢复大鼠I/R前后心脏的左室发展压(P<0.05)，左心室舒张末期压亦明显下降;100 μmol/L PTX治疗组在I/R 5 min时明显降低TNFα的含量(P<0.05)。结论 PTX提高大鼠缺血缺氧后心肌收缩力的恢复水平，增强心肌缺血缺氧的耐受性。改善心肌I/R引起的TNFα生成可能是其心肌保护作用的机制之一。

【关键词】 己酮可可碱;缺血再灌注;肿瘤坏死因子α

研究表明，己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)具有保护心血管损伤、改善慢性心衰患者及特发性扩张型心肌病患者心功能的作用〔1〕，但其对心肌缺血再灌注(ischemiareperfusin，I/R)损伤的作用及其机制尚未见报道。本文旨在研究PTX对心肌损伤的保护作用及其机制，为PTX的临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料及动物 清洁级Wistar大鼠(吉20030001)，体重250～300 g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供;PTX购自Sigma公司，其他试剂均购自北京化学试剂厂;蠕动泵购自兰格恒流泵有限公司。

　　1.2 分组 120只健康雄性Wistar大鼠，随机分为12组，每组10只： (1)正常对照组：含氧灌流液灌流80 min;(2)缺血(I)组：灌流液预灌注20 min，停止灌注30 min;(3～6)I/R 5、10、20、30 min组：均为灌流液预灌注20 min，停止灌注30 min，再灌注时间分别为5、10、20、30 min;(7)PTX 100 μmol/L对照组;(8)PTX 100 μmol/L缺血组;(9)PTX 100 μmol/L I/R 5 min组;(10)PTX 100 μmol/L I/R 10 min组;(11)PTX 100 μmol/L I/R 20 min组： (12)PTX 100 μmol/L I/R 30 min组;治疗组灌注方法同I/R组，但在缺血前10 min及再灌注期持续给药至实验结束;记录各组血流动力学指标。

　　1.3 Langendorff灌流 乌拉坦(1g/kg) 腹腔麻醉，经舌下静注肝素5 mg/kg，分离心脏。将其立即放入KrebsHenseleit(KH) 缓冲液(120 mmol/L NaCl，4.8 mmol/L KCl，1.35 mmol/L CaCl2，1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L Kh3PO4，25 mmol/L NaHCO3，11 mmol/L 葡萄糖，pH7.4)。于液面下行主动脉插管，丝线结扎固定。将心脏接入Langendorff灌流装置上，用95% O2、5% CO2平衡的37℃ KH液行主动脉逆行恒压灌流，灌流压力为80 cmh3O，611刺激器 (Phipps & Bird，Richmond，USA)维持心脏博动300次/min。充水气球插入左心室并连接压力换能，左室舒张末期压(LVEDP)在实验开始调整为9～10 mmHg，通过BL420系统(成都泰盟)记录左心室发展压(LVDP)、LVEDP、左心室压上升最大速率(+dP/dt)及下降最大速率(-dP/dt)，并计算实验结束时恢复率(当前值/基础值)。

　　1.4 肿瘤坏死因子α(TNFα)含量检测 取心肌100 mg溶于1 ml磷酸盐缓冲液 (含1% Triton X100及蛋白酶抑制剂)中匀浆，4℃离心20 min，取上清-20℃保存。严格按照TNFα ELISA试剂盒说明书进行检测。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS10.0软件，实验结果以x±s表示，两组间比较采用t检验;组内比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

　　2 结 果

　　2.1 PTX对心肌I/R损伤血流动力学的影响 见表1。缺血组和I/R 30 min组可以引起显著的心功能抑制。I/R 5 min后LVEDP明显升高，是缺血前的40倍;LVDP 明显降低缺血前的14倍。30 min再灌后LVDP显著降低了缺血前的10倍(P<0.01)，而LVEDP显著升高是缺血前的30倍(P<0.05);同时±dP/dt亦显著降低是缺血前的10倍(P<0.05)。PTX 100 μmol/L缺血前10 min给药，再灌注5、10、20、30 min时均明显改善左心室功能(P<0.05)，再灌注30 min后±dP/dt恢复60%(P<0.05)，LVEDP亦明显降低了48%。PTX缺血前10 min给药可在再灌注20及30 min时显著升高LVDP恢复率。

　　2.2 PTX对I/R损伤引起TNFα含量变化的影响 再灌注5 min是心肌缺血缺氧再复氧损伤最严重的时期，TNFα含量在再灌注5 min时的含量变化亦证明这一点。在缺血30 min再灌注5 min时心肌中TNFα蛋白含量显著升高(P<0.05)，而PTX(100 μmol/L)可在5 min再灌注后显著降低TNFα含量。30 min再灌注后TNFα含量与对照组相比变化不明显(表2)，考虑是因为在心肌I/R 30 min时部分细胞坏死导致细胞内TNFα释放入灌注液中，故心肌组织中含量并未表现升高。　　表1 PTX对缺血再灌注心肌左室压力、心室压力变化速率及LVDP恢复率的影响表2 PTX对I/R引起TNFα含量的影响与对照组比较：1)P<0.05;与I/R 5 min组比较：2)P<0.05

　　3 讨 论

　　在20世纪70年代，有学者提出I/R损伤概念。所谓I/R损伤是指细胞因缺血发生可逆性、可存活的损伤，在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍〔4～6〕。心肌是发生I/R损伤的最常见组织之一，心功能是反映心肌缺血或损伤严重程度的指标，血流动力学研究是观察药物对心血管功能影响的常用手段之一。心肌LVDP、LVEDP、左心室最大压力变化速率可以反映心脏功能〔7〕。本文通过制作全心I/R模型，观察PTX对上述指标的影响，评价PTX对心肌的保护作用。结果显示PTX可明显逆转心肌I/R引起的血液动力学改变，I/R前后的左室压以及最大压力上升速率(dp/dt)的恢复率与对照组相比有显著性差别，同时恢复程度与给药浓度呈正相关，说明PTX有稳定血流动力学的作用。稳定的血流动力学效应是保证冠状动脉有效灌注的前提，PTX可以提高大鼠缺血缺氧后心肌收缩力的恢复水平，增强心肌缺血缺氧的耐受性，可以有效地保护缺氧心肌。

　　有研究发现，TNFα 是参与心肌I/R损伤发病机制的重要因子之一，I/R与心肌TNFα的生成密切有关〔3〕。最近的研究显示，心肌持续性缺血可导致组织损伤和细胞死亡。早期再灌注对组织非常重要，再灌注后可导致缺血的心肌损伤更为严重，即再灌注损伤。TNFα是一种重要的炎性细胞因子，可通过多种机制诱导心肌I/R损伤。它不仅可激活细胞因子级联反应，而且可促进氧自由基产生、活化中性粒细胞、诱导心肌细胞凋亡等，加重心肌I/R损伤。TNFα参与心肌I/R损伤，并在心肌细胞凋亡中发挥重要作用。因此通过阻断TNFα的产生，抑制其活化就可能减轻缺血I/R损伤及细胞凋亡的发生。研究表明，给予抗TNFα的单克隆抗体或可溶性TNF受体可阻断TNFα的活性〔6，7〕;给予腺苷、钙拮抗剂、抗氧化剂等药物预处理，可以减少TNFα产生或释放〔8～10〕;对心肌进行缺血预处理或后处理，可以减轻I/R损伤及细胞凋亡的发生〔11～12〕。因此，抗TNFα治疗将为临床防治心肌I/R损伤提供良好前景。本研究显示缺血30 min后再灌注5 min TNFα 生成明显升高，PTX能够抑制其升高;再灌注30 min时心肌TNFα含量只是略有升高，其原因为心肌细胞再灌注损伤引起心肌坏死导致的TNFα释放入灌注液引起。这一结果提示，PTX可能通过降低TNFα生成发挥其对I/R的心肌保护作用，反映了PTX改善I/R的心室收缩功能不仅是通过PTX传统的改善血流变学特性，亦可能与抑制TNFα的生成密切相关。

参考文献

　1 黄道秋，熊德巧.己酮可可碱的临床应用概况〔J〕.中国药事，2005;19(3):1724.

　　2 吕志敢，郭 政.肿瘤坏死因子的研究进展〔J〕.山西医科大学学报，2006;37(3):3114.

　　3 吴佳妮，唐旭东，吴 凡，等.抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及与核因子κB活化的关系〔J〕.西南军医，2007;9(3):313.

　　4 Rathi SS，Xu YJ，Dhalla NS，Mechanism of cardioprotective action of TNFα in the isolated rat heart〔J〕.Exp Clin Cardiol，2002;7(23):146150.

　　5 韦 薇，沈爱华.心肌缺血再灌注损伤机制及保护因素〔J〕.中国现代医药杂志，2007;9(7):12831.

　　6 Kieszko R，Krawczyk P，Chocholska S，et al.Tumor necrosis factor receptors (TNFRs) on T lymphocytes and soluble TNFRs in different clinical courses of sarcoidosis〔J〕.Respir Med，2007;101(3):645.

　　7 Mizoguchi E，Hachiya Y，Kawada M，et al.TNF receptor type Idependent activation of innate responses to reduce intestinal damageassociated mortality〔J〕.Gastroenterology，2008;134(2):470.

　　8 Eckle T，Khler D，Lehmann R，et al.Hypoxiainducible factor1 is central to cardioprotection:a new paradigm for ischemic preconditioning〔J〕. Circulation，2008;118(2):166.

　　9 Moulin M，Carpentier S，Levade T，et al.Potential roles of membrane fluidity and ceramide in hyperthermia and alcohol stimulation of TRAIL apoptosis〔J〕.Apoptosis，2007;12 (9):170320.

　　10 Seelinger G，Merfort I，Schempp CM.Antioxidant，antiinflammatory and antiallergic activities of luteolin〔J〕.Planta Med，2008;74(14):166777.

　　11 Kimura H，ShintaniIshida K，Nakajima M，et al.Ischemic preconditioning or p38 MAP kinase inhibition attenuates myocardial TNF alpha production and mitochondria damage in brief myocardial ischemia〔J〕.Life Sci，2006;78(17):190110.

　　12 Sadat U，Walsh SR，Varty K.Cardioprotection by ischemic postconditioning during surgical procedures〔J〕.Expert Rev Cardiovasc Ther，2008;6(7):9991006.