葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用

【摘要】 目的 观察葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症反应的抑制作用并探讨其作用机制。方法 36只SD大鼠随机分成假手术组、模型组和葛根素处理组;采用左冠状动脉结扎法复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，于缺血开始及再灌注即刻由尾静脉注射葛根素20 mg/kg，缺血1 h，再灌注6 h后取血检测缺血再灌注后心肌髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)和血清磷酸肌酸激酶(CK)含量，RTPCR测定缺血再灌注后心肌胞间黏附分子1(ICAM1) mRNA含量。结果 葛根素组血清CK明显低于模型组(P<0.01)，MPO和MDA的活性明显低于模型组(P<0.01)，ICAM1 mRNA含量较模型组低(P<0.01)。结论 葛根素可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症反应，这可能是其发挥心肌保护机制之一。

【关键词】 葛根素;再灌注损伤;胞间黏附分子1

近年研究证明，心肌缺血再灌注损伤后氧自由基产生与炎症反应是引起继发性心肌损伤的关键因素。在缺血心肌组织内，大量的中性粒细胞和单核细胞聚集、浸润，阻塞微血管，造成“无复流”现象，并且聚集的中性粒细胞和单核细胞释放氧自由基、蛋白质分解酶及各种炎性介质加重心肌损伤〔1〕;缺血区微血管内皮细胞黏附分子的上调，是中性粒细胞和单核细胞聚集、浸润的先决条件〔2〕。药理实验研究显示，葛根素具有保护心肌缺血再灌注损伤作用〔3〕，但这种作用是否与葛根素抑制心肌缺血区细胞黏附分子表达上调相关，目前还不清楚。本实验通过观察葛根素对大鼠心肌缺血再灌注损伤后炎症反应以及缺血区细胞黏附分子表达的影响，探讨其心肌保护作用机制，为临床用药提供理论依据和参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物和试剂 布瑞宁(注射用葛根素，北京四环科宝制药有限公司生产，0.1 g/支，批号h30010776);肌酸激酶(CK)活力试剂盒、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒和丙二醛(MDA) 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;总RNA提取试剂购自美国Gibco公司;小鼠白血病病毒反转录酶(MMLV)、寡核苷酸引物购自美国Promega公司;耐热DNA(Taq DNA)聚合酶、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)等试剂购自深圳华美生物工程公司。

　　1.2 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型 参照文献〔4〕的方法并改良。具体操作如下:大鼠经10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉、固定，气管插管接小动物呼吸机，记录心电图。胸骨左缘第四肋间隙开胸，剪开心包，在左心耳下缘3～4 mm处进针，向肺动脉园锥方向出针，将一小段聚乙烯管(直径1.5 mm)置于结扎线下，收紧结扎线以阻断左冠状动脉前降支(LAD)血流。观察心电图，以出现QRS波群高大增宽为结扎成功，缺血60 min后，取出聚乙烯管即再灌注，以QRS波群振幅逐渐回落为再灌注成功标志〔5〕;再灌注6 h，股动脉取血，处死动物，保留心肌。正常对照组用正常心肌，模型组和葛根素组用同一部位的缺血心肌检测。

　　1.3 实验分组 SD大鼠36只，雌雄不拘，体重200～250 g，随机分成3组，①正常对照组：开胸，左冠状动脉降支下穿线但不结扎，同一时间点尾静脉注射等量的生理盐水;②模型组：缺血60 min，再灌注6 h，缺血开始及再灌注即刻尾静脉注射等量的生理盐水;③葛根素组：缺血1 h，再灌注6 h，缺血开始及再灌注即刻由尾静脉注射葛根素20 mg/kg。

　　1.4 血清CK活性测定 再灌注结束后，股动脉取血，离心分离血清，按试剂盒说明书操作。

　　1.5 心肌MPO、MDA含量测定 严格按试剂盒说明书操作。用硫代巴比妥酸比色法测定MDA的活性变化。

　　1.6 心肌ICAM1 mRNA测定 Trizol法提取总RNA，采用紫外分光光度计测定A260和A280的吸光度值，保证RNA的质量，并计算RNA的浓度。采用RNA PCR试剂盒进行逆转录和PCR，逆转录反应体系(20 μl)如下：RNA 1 μg，10×RNA PCR Buffer 2 μl，MgCl2 5 mmol/L，dNTP 1 mmol/L，Oligo (dT) 2.5 pmol，AMV 5 U，RNase inhibitor 20 U;逆转录条件如下:30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，离心，-20℃备用。PCR所需的引物系列如下：ICAM1:前向:5′GGCGTCCATTTACACCTATTA3′，反向：5′TTCCTTTTCTTCTCTTGCTTG3′ (413 bp);甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)：前向:5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′，反向:5′AGATCCACAACGGATACATT3′ (306 bp);PCR反应体系(50 μl)如下:DNA 2.5 μl，10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各50 pmol;PCR扩增条件为95℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环，最后72℃ 5 min。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，将电泳结果以凝胶分析系统(Imager 2000)进行半定量分析，以ICAM1和GAPDH的比值来表示ICAM1 mRNA表达的强弱。

　　1.7 统计学分析 用SPSS11.5软件进行统计学处理，数据以x±s表示，各组均数的比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 血清CK活力及心肌MPO、MDA含量的变化 模型组CK活力明显高于对照组(P<0.01)，葛根素组活力则明显低于模型组(P<0.01)。葛根素组MPO、MDA活性明显低于模型组(P<0.01)，模型组明显高于对照组(P<0.01)，见表1。

　　2.2 心肌ICAM1 mRNA水平的变化 PCR凝胶电泳结果显示:各组PCR扩增产物均于413 bp处出现了背景清晰但亮度不同的条带，表示各组均有ICAM1 mRNA表达。对各组条带进行光密度扫描，可见对照组ICAM1 mRNA表达较弱，模型组ICAM1 mRNA表达明显高于对照组(P<0.01)，葛根素组活性明显低于模型组(P<0.01)，见表1、图1。表1 各组大鼠血清CK活力和心肌MPO、MDA含量、ICAM1 mRNA变化比较与正常对照组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01

　　3 讨 论

　　随着心肌缺血机制研究的日益深入，炎症反应在心肌缺血再灌注的作用引起关注。在心肌缺血的情况下，活化的白细胞作用于血管基底膜而进入心肌组织，浸入的白细胞主要是中性粒细胞和单核细胞，MPO是这两种细胞特有的酶，白细胞通过阻塞小血管、释放化学介质和自由基等参与内皮细胞的损伤，改变血管内皮细胞的通透性。所以缺血再灌注组织中白细胞的存在不仅是损伤的病理反应，而且促进缺血再灌注的损害。本实验研究显示：缺血心肌中MPO、MDA和血清中CK活性显著升高，即缺血区发生炎症反应，且浸润的白细胞产生自由基增多，从而诱导心肌组织受伤加重。而葛根素处理组MPO、MDA和血清中CK活性显著下降，说明葛根素能减轻炎症介导的缺血再灌注损伤。

　　白细胞穿过血管进入病灶需要ICAM1的介导，ICAM1是一种淋巴细胞功能相关抗原1(Lymphocyte function associated antigen1)的配体，主要介导白细胞和内皮细胞黏附，使白细胞游出血管壁。在正常情况下，内皮细胞表达极微量的ICAM1，白细胞极少和内皮细胞黏附。在缺血再灌注时，内皮细胞和白细胞被病变组织产生的大量组织激活，ICAM1表达增高〔6〕，使白细胞和内皮细胞黏附增强，造成白细胞和内皮细胞大量牢固黏附，堵塞微循环，影响心肌组织的血液供应;此外，浸润于心肌的白细胞产生大量的自由基、水解酶、炎症介质和细胞因子等，损伤局部血管，使心肌细胞缺血、缺氧，甚至死亡，并吸引更多的白细胞进入心肌，形成恶性循环，所以黏附分子的表达是白细胞发挥毒性作用的重要条件〔7〕。研究发现，心肌缺血再灌注损伤中ICAM1明显升高，且与心肌损伤一致〔8〕;本实验中，模型组ICAM1 mRNA量明显高于对照组，且与MPO、MDA和血清中CK活性变化一致。

　　ICAM1介导的炎症反应在心肌缺血再灌注损伤中的作用越来越受到关注，寻找新的方法预防这种炎症反应以减轻心肌缺血再灌注损伤是目前的研究热点。本实验通过观察葛根素对白细胞浸润、自由基产生、心肌损伤程度和ICAM1 mRNA含量的影响研究葛根素对心肌缺血再灌注的保护作用，表明葛根素有减轻白细胞和内皮细胞的黏附作用，减少自由基产生，从而减轻心肌缺血再灌注中的炎症反应，达到保护心肌的作用。

参考文献

　1 Sievert A.Leukocyte depletion as a mechanism for reducing neutrophilmediated ischemicreperfusion injury during transplantation〔J〕.J Extra Corpor Technol，2003;35(1):4852.

　　2 Jones SP，Trocha SD，Strange MB，et al.Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules in a chronic murine model of myocardial reperfusion injury〔J〕.Am J Physiol Heart Clrc Physiol，2000;279(5):2196201.

　　3 潘洪平.葛根总黄酮和葛根素的药理作用和临床应用研究进展〔J〕.广西医学，2003;25(10)：19414.

　　4 郭 鹞.人类疾病动物模型〔M〕.北京:人民卫生出版社，1982：365567.

　　5 陈运贞，王志华.大白鼠实验性心肌缺血再灌注模型制备与心电图改变的特点〔J〕.重庆医科大学学报，1998;23(1):811.

　　6 Ziegelstein RC，He C，Hu Q.Hypoxia/reoxygenation stimulates Ca2+dependent ICAM1 mRNA expression in human aortic endothelial cells〔J〕. Biochem Biophys Res Commun，2004;322(1):6873.

　　7 Metzler B，Mair J，Lercher A，et al.Mouse model of myocardial remodelling after ischemia：role of intercellular adhesion molecule1〔J〕. Cardiovasc Res，2001;49(2)：399407.

　　8 Yang XP，Irani K，Mattagajasingh S，et al.Signal transducer and activator of transcription 3〔alpha〕 and specificity protein 1 interact to upregulate intercellular adhesion molecule1 in ischemicreperfused myocardium and vascular endothelium〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005;25(7):1395400.