大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

　　　　作者：王光兰 陈爽 张丽红 范 颖 石英爱 孙华君 刘晓会 吴珊

【摘要】 目的 建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法 无菌取Wistar大鼠肾脏，取皮质剪碎，经Ⅰ型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代，观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结果 培养4～5 d细胞融合成单层，呈典型的鹅卵石样，细胞角蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性，细胞可传2～3代。结论 此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞，为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。

【关键词】 近端肾小管上皮细胞;原代培养;大鼠

　　【Abstract】 Objective To establish the better model for primary culture of rat proximal tubule epithelial cells(PTCs).Methods Wistar rats kidney were sterile taken out， then the cortex was separated and shredded， purified by collagenase Ⅰdigestion and 45% percoll discontinuous density gradient centrifugation， cultured and passaged by DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum， identified by morphology， immunocytochemistry staining and enzyme staining.Results After 4 to 5 days，the cells were inosculated into a single layer and showed the typical cobblestonelike appearance.The cytokeratin18 and alkaline phosphatase staining were positive， the cells could be passed 2～3 generation.Conclusions This method can yield large quantity and good repeatability PTCs in short term，those cells can provide an experimental platform for the research of pathological changes and lesions.

　　【Key words】 Proximal tubule epithelial cells;Primary cultrue;Rat

　 肾脏纤维化是多种肾脏疾病发展至肾衰竭终末期的共同表现，肌成纤维细胞在此过程中发挥重要作用。目前，肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化是纤维化过程中成纤维细胞和肌成纤维细胞的来源之一〔1〕。因此，建立良好的近端肾小管上皮细胞的体外培养模型，对于肾小管上皮细胞疾病的研究十分重要，本实验旨在探讨大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料、试剂 体重180～220 g的雄性Wistar大鼠(吉林大学基础医学院实验动物中心);Ⅰ型胶原酶(Sigma);优级胎牛血清(Hyclone);DMEM/F12培养基(Gibco);细胞角蛋白18(CK18)多克隆抗体(北京博奥森公司);SP试剂盒、DAB试剂盒(福州迈新公司)。

　　1.2 肾小管上皮细胞的分离培养 大鼠实验前12 h禁食，自由进水。颈椎脱臼处死后，75%酒精浸泡5 min，无菌取双肾，置于冷PBS中，去除肾蒂及包膜，切取薄层肾皮质，剪碎至1 mm3大小，PBS洗3遍，离心800 r/min，5 min;所得沉淀加入终浓度为1 g/L的Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化30 min，将消化后的组织碎块转移至80目不锈钢网上，过滤、研磨并用DMEM/F12培养基冲洗;网下液体再经200目筛网过滤后，1 000 r/min离心5 min。取沉淀用45% Percoll分离液25 ml重悬制备细胞悬液。将细胞悬液小心铺于含5 ml 100% Percoll分离液的离心管中，14 000 r/min，4℃条件下离心25 min可见液体分层。吸取近管底第2层细胞悬液，即为近端肾小管节段及其游离的上皮细胞。DMEM/F12培养1 000 r/min，10 min 离心液洗除残留的Percoll分离液。将分离的近端肾小管上皮细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬后接种于培养皿中，于37℃，5%CO2孵箱中静置培养，隔天换液。原代培养4～5 d后细胞长满，0.05%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，待细胞变圆后弃胰酶，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化并传代，继续培养。

　　1.3 近端肾小管上皮细胞的鉴定 倒置显微镜下观察培养细胞的形状及生长情况。免疫细胞化学染色：制备细胞爬片，固定后以CK18抗体为一抗，SP法进行免疫细胞化学染色，二抗为羊抗鼠/兔IgG，阴性对照用PBS代替一抗。钙钴法碱性磷酸酶染色，作用底物为β甘油磷酸钠。

　　2 结 果

　　图1 肾小管上皮细胞原代培养第4天(200×)2.1 形态学观察 经上述方法分离纯化后获得的大量肾小管节段及细胞，镜下细胞圆形清亮，折光良好，状态甚佳，视野中仅见少量肾小球掺杂。培养第2天即可在肾小管节段组织块周围见到大量上皮样细胞，4～5 d后可见细胞融合成单层，细胞间衔接紧密，呈典型的多边形鹅卵石样，状态甚好(图1)。细胞经首次1∶3传代后贴壁迅速，生长良好，形状无明显改变。但再次传代后细胞贴壁稍欠佳，生长减慢，第3代细胞贴壁生长均不良，呈明显老化状态，此时残留的少量成纤维细胞及系膜细胞样细胞生长渐成优势。

　　2.2 免疫细胞化学染色 原代培养和第1次传代的细胞经CK18免疫细胞化学染色证实所培养细胞均为阳性，表明为上皮细胞，显微镜下胞浆中出现棕黄色颗粒，分布不均，强弱不等，有少量空泡，苏木精复染细胞核着色浅淡(图2)。

　　图2 传1代细胞CK18免疫细胞化学染色(SP法，200×)

　　2.3 碱性磷酸酶染色 原代培养和第1次传代的细胞可见胞浆中有淡灰色、黑色颗粒，各细胞强弱不等，分布不均，表明为肾小管上皮细胞(图3)。

　　图3 传1代细胞碱性磷酸酶染色(钙钴法，100×)

　　3 讨 论

　　体外细胞培养作为一种常用的实验研究方法，其在病理学、生理学及毒理学等各领域研究中的应用十分广泛。由于肾小管上皮细胞参与多种肾脏疾病的发生发展，特别是近几年研究发现多种肾脏疾病的终末期改变——肾纤维化的发生也离不开肾小管上皮细胞的参与，加速了肾小管上皮细胞体外培养技术的成熟。目前尽管已有不同动物的肾小管上皮细胞体外培养细胞株，如猪LLCPK1细胞株，人HK2、HKC细胞株等，但这些细胞株的建立大部分经过基因转染技术，使其在结构和功能等方面与体内正常的肾小管上皮细胞有或多或少的差别，而原代细胞培养具有细胞性质与体内细胞状况更相近的独特优势，是这些细胞株无法比拟的。

　　本实验采用Percoll密度梯度分离法获得的细胞数量较多，分离后细胞原代培养活力甚佳、生长迅速。CK是上皮细胞的特异性标记，据报道肾小管上皮细胞优先表达CK18，但肾脏中肾小球上皮细胞也有CK表达〔2，3〕。本研究经CK18免疫细胞化学染色显示获得的细胞为上皮细胞，为进一步确认，本研究进一步检测了细胞的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶是近端小管上皮细胞刷状缘上的标志酶，只有近端肾小管上皮细胞该酶染色呈阳性，结果显示获得的原代培养细胞碱性磷酸酶化学染色为明显阳性，且显微镜观察细胞形态呈典型的鹅卵石样，均说明获得的细胞是近端肾小管上皮细胞。

　　目前虽然已建立了几种肾小管上皮细胞的分离纯化方法〔4〕，但分离的细胞中时有少量的肾小球掺杂，本实验的分离中也间有肾小球掺杂的现象，如何获得更为精纯的近端肾小管上皮细胞尚需进一步摸索。另外，本实验体外培养的细胞只能传代培养1～2次，再次传代时细胞状态欠佳，细胞体外存活时间相对较短，考虑可能与选择的大鼠鼠龄较大有关。添加一些利于细胞生长的物质如：胰岛素、转贴蛋白、三碘甲状原氨酸等能否延长其体外培养时间尚需进一步观察。

参考文献

　1 Fan JM，Ng YY，Hill PA，et al.Transforming growth factorβ regulates tubular epithelialmyofibroblast transdifferentiation in vitro〔J〕.Kidney，1999;56(4)：145567.

　　2 蔡文琴，王伯沄.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术〔M〕.成都：四川科学技术出版社，1994:102.

　　3 Mattila PM，Nietosvaara YA，Ustinov JK，et al.Antigen expression in different parenchymal cell types of rat kidney and heart〔J〕.Kid Int，1989;36(2):22833.

　　4 喻 陆.肾小管上皮细胞的分离方法与原代培养〔J〕.国外医学·临床生物化学与检验学分册，1995;25(6):2579.