Bcl2蛋白在体外阿尔茨海默病样神经细胞退化中的保护作用

【摘要】 目的 在体外水平探讨抗凋亡蛋白Bcl2在蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸所诱导的阿尔茨海默病(AD)样神经细胞损伤中是否具有保护作用。方法 以人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y作为体外神经细胞研究材料，用G418筛选稳定转染重组质粒PcDNA3bcl2的细胞克隆，以Western印迹鉴定外源性Bcl2蛋白的表达，MTT还原法检测细胞活力，DNA荧光染料染色法检测细胞凋亡率。结果 G418筛选出重组质粒PcDNA3bcl2和空质粒PcDNA3稳定转染的细胞克隆，前者高表达Bcl2蛋白，而后者不表达该蛋白;用250 nmol/L经典促凋亡剂星形孢菌素分别处理稳定转染PcDNA3bcl2和PcDNA3的细胞24 h，前者的细胞活力(92.5%±8.6%)显著高于后者(65.1%±7.2%)(P<0.01)，前者的细胞凋亡率(10.0%±1.5%)显著低于后者(38.1%±4.7%)(P<0.01);用80 nmol/L冈田酸分别处理稳定转染PcDNA3bcl2和PcDNA3的细胞24 h，前者的细胞活力(78.7%±6.4%)显著高于后者(59.2%±5.1%)(P<0.05)， 前者的细胞凋亡率(27.2%±3.0%)显著低于后者(46.6%±5.2%)(P<0.05)。结论 体外神经细胞中外源性高表达的Bcl2蛋白能显著抑制冈田酸所致细胞损伤，在AD样神经细胞损伤中有保护作用。

【关键词】 Bcl2蛋白;阿尔茨海默病;神经细胞;蛋白磷酸酶抑制剂;转染

tau蛋白过度磷酸化是阿尔茨海默病(AD)中神经细胞退化的关键性分子机制之一〔1〕。AD病人脑中蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性降低是导致tau蛋白过度磷酸化的主要原因〔2〕。冈田酸(OA)是PP2A的特异性抑制剂。OA通过特异性降低PP2A活性，引起tau蛋白过度磷酸化以及后续的神经细胞凋亡性退化〔3〕。凋亡机制很可能参与AD中神经细胞退化。作者〔4〕在大鼠一侧脑额叶皮质单位点注射OA，出现tau过度磷酸化，且tau过度磷酸化与细胞凋亡有关。Bcl2家族蛋白所调控的线粒体凋亡通路在生理性和病理性凋亡中普遍存在。为了明确Bcl2蛋白是否参与OA所诱导的AD样神经细胞退化，本研究以体外培养的人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y为研究对象，探讨Bcl2蛋白在蛋白磷酸酶抑制剂OA诱导的AD样神经细胞退化中是否具有细胞保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 研究对象 人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y为中国医学科学院基础所自德国HyperCLDB细胞培养机构引进的连续传代肿瘤细胞株。

　　1.1.2 主要仪器 美国产Forma恒温培养箱，美国产BioRad 450型酶标仪，德国产Leica DMIRB倒置荧光显微镜，北京六一仪器厂产DFC电泳仪、垂直电泳槽和电转槽。

　　1.1.3 主要试剂 美国Gibco BRL公司产 RPMI1640培养基、脂质体Lipofectamine 2000和G418;美国Hyclone 公司产15%胎牛血清(FCS);上海实生细胞生物技术公司进口分装3(4， 5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴盐 (MTT);美国Sigma 公司产Hoechst 33258，小鼠βactin单克隆抗体，星形孢菌素(STS) 和OA;美国Clontech公司产真核表达质粒PcDNA3;美国Santa Cruz Biotechnology公司产兔Bcl2多克隆抗体和化学发光试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 SHSY5Y细胞常规培养所用的完全性培养基：RPMI1640培养基，15% FCS;15mmol HEPES;100 U/ml青霉素;100 μg/ml链霉素。

　　1.2.2 转染 ①重组质粒构建。真核表达质粒PcDNA3，CMV启动子，多克隆位点(MCS)后接编码Bcl2 的cDNA序列，将该重组质粒命名为PcDNA3bcl2。②稳定转染。脂质体介导重组质粒PcDNA3bcl2和空质粒PcDNA3分别瞬时转染SHSY5Y细胞;细胞常规培养36 h，其间更换一次完全培养基;用梯度浓度的G418确定合适的最低浓度筛选转染成功的细胞，收获克隆细胞培养、传代、冻存。

　　1.2.3 Western印迹鉴定外源性蛋白的表达 对G418筛选出的重组质粒PcDNA3bcl2和空质粒PcDNA3稳定转染细胞进行以下处理：①制备细胞总裂解物;②SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;③转膜;④Bcl2抗体(1∶1 000)和内对照βactin的抗体(1∶1 000)免疫;⑤发光剂作用后显影冲片。

　　1.2.4 转染细胞给药方法 将重组质粒和空质粒稳定转染的细胞分别接种于24孔板，在无抗生素的完全性培养基中生长至约70%～80%细胞满底时给药处理24 h。

　　1.2.5 细胞活力的检测 MTT还原法①细胞长至70%～80%满底时给药，设载体对照孔和空白对照孔;②250 nmol/L STS或80 nmol/L OA作用24 h;③每孔加入5 mg/ml MTT;④避光作用4 h;⑤每孔加入结晶溶解液;⑥37℃过夜溶解结晶;⑦450型酶标仪在570 nm波长处测定吸收值;⑧以载体对照组为100%细胞存活，计算OA各浓度组的细胞活率。细胞活率(对照的百分比) = (给药组平均吸收值空白对照组平均吸收值)/(载体对照组平均吸收值空白对照组平均吸收值)×100%。实验重复3次，取平均值。

　　1.2.6 细胞凋亡率的检测 Hoechst 33258染色法。①4%多聚甲醛于4℃固定细胞30 min;②1 μg/ml Hoechst 33258染色，37℃ 15 min;③甘油PBS覆盖细胞;④倒置荧光显微镜(×20)和物镜(×40)下观察细胞核形，随机选取视野，计算300个细胞中凋亡细胞所占百分比即为细胞凋亡率。

　　1.2.7 外源性Bcl2蛋白的生物活性的鉴定 已知Bcl2蛋白能显著地抑制经典促凋亡剂STS所诱导的细胞凋亡。用250 nmol/L STS处理重组质粒和空质粒稳定转染的SHSY5Y细胞24 h后，用MTT还原法检测两组的细胞活力，采用DNA染料Hoechst 33258染色法检测两组细胞的凋亡率，若重组质粒组的细胞活力显著高于空质粒组，且细胞凋亡率显著低于空质粒组，则可鉴定为外源性表达Bcl2蛋白具有抗凋亡的生物功能，即转染成功。

　　1.3 统计学处理 所有数据用x±s表示，两组数据之间的比较用Student t检验。

　　2 结 果

　　2.1 PcDNA3bcl2和PcDNA3稳定转染的细胞克隆Bcl2的表达 结果显示重组质粒(PcDNA3bcl2)稳定转染的细胞明显表达Bcl2蛋白，而空质粒(PcDNA3)稳定转染的细胞不表达Bcl2蛋白(见图1)。

　　2.2 对重组质粒和空质粒转染SHSY5Y细胞活力测定结果 重组质粒组的细胞活力(92.5%±8.6%)显著高于空质粒组(65.1%±7.2%)(P<0.01);重组质粒组的细胞凋亡率(10.0%±1.5%)显著低于空质粒组(38.1%±4.7%)(P<0.01)。

　　2.3 Bcl2蛋白对OA所引起的SHSY5Y细胞凋亡的影响 用80 nmol/L OA处理重组质粒和空质粒稳定转染的SHSY5Y细胞24 h，重组质粒组细胞活力(78.7%±6.4%)显著高于空质粒组(59.2%±5.1%)(P<0.05);前者的细胞凋亡率(27.2%±3.0%)显著低于后者(46.6%±5.2%)(P<0.05)。OA引起细胞核形发生凋亡样改变，即染色质浓聚、碎裂，载体处理细胞后，细胞核形正常，即染色质均匀淡染、呈类圆形，80 nmol/L OA处理重组质粒转染细胞24 h后，呈凋亡样核形改变的细胞数量显著少于同剂量药物同时间所处理的空质粒转染细胞(见图2)。

　　3 讨 论

　　虽然作者〔4〕在整体水平实验中观察到，OA引起神经细胞内抗凋亡蛋白Bcl2表达上调，但未能确定Bcl2高表达的功能意义，因此本研究设计了体外水平实验进一步探讨Bcl2高表达是否具有对抗OA所致神经细胞退化的细胞保护作用。

　　据文献〔5〕报道，OA能诱导人神经母细胞瘤细胞株SHSY5Y的tau蛋白在多个特异位点发生磷酸化，且异常磷酸化tau蛋白与微管结合能力降低、微管结构失稳定，并引起细胞凋亡。因此本研究应用OA处理SHSY5Y，作为研究AD样体外神经细胞退化的模型。首先用重组质粒PcDNA3bcl2稳定转染SHSY5Y细胞，以空质粒PcDNA3稳定转染该种细胞作为对照。再用Western印迹法确认重组质粒转染的细胞高表达外源性Bcl2蛋白，而空质粒转染的细胞不表达Bcl2蛋白。然后用250 nmol/L经典促凋亡剂STS处理两种转染细胞24 h(该剂量该时程STS处理能使SHSY5Y细胞近半数凋亡)，结果显示重组质粒转染的细胞活力显著高于空质粒转染的细胞，与此一致，重组质粒转染的细胞凋亡率显著低于空质粒转染的细胞，这表明外源性表达的Bcl2蛋白是具有抗凋亡功能的生物活性蛋白，这是检测Bcl2高表达是否能对抗OA所致神经细胞退化的必要前提。

　　在肯定了外源性高表达Bcl2蛋白具有抗凋亡活性的基础上，检测了Bcl2高表达对OA所致SHSY5Y细胞凋亡的影响。用80 nmol/L OA处理两种转染细胞24 h(该剂量该时程OA处理能使SHSY5Y细胞近半数凋亡)，结果显示重组质粒转染的细胞活力显著高于空质粒转染的细胞，而重组质粒转染的细胞凋亡率显著低于空质粒转染的细胞。尽管外源性高表达的Bcl2蛋白营救OA所致细胞凋亡的作用不如营救STS所致细胞凋亡那样完全，但该实验结果依然提示Bcl2蛋白在AD样神经细胞损伤中有细胞保护作用。

参考文献

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