苦参碱对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

　　　　 作者：傅松波 汤旭磊 贾丽云 乔成栋 马志远

【摘要】 目的 探讨苦参碱对糖尿病(DM)大鼠肾脏的保护作用及机制。方法 采用单侧肾切除、腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病肾病(DN)大鼠模型，并设立正常对照(NC)组;DN对照(DN)组，苦参碱治疗组(MT)(100 mg·kg-1·d-1)，腹腔给药8 w后处死所有大鼠，检测苦参碱对DM大鼠肾功能的影响，病理切片HE染色，观察肾脏病理改变，免疫组化检测肾组织转化生长因子β1(TGFβ1)的表达水平。结果 与NC组大鼠比较，DN组大鼠尿蛋白排泄量增多，肾小球体积增加，血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)升高，肾组织TGFβ1表达上调(P<0.01)。苦参碱明显减少DN大鼠尿蛋白排泄量，降低血清BUN、Cr水平(P<0.05，P<0.01)，肾小球体积明显改善，肾组织TGFβ1表达明显下调(P<0.05，P<0.01)。结论 苦参碱显著改善抑制肾脏TGFβ1表达，改善肾小球肥大，减轻蛋白尿，对DM大鼠肾损害具有保护作用。

【关键词】 苦参碱;糖尿病肾病;转化生长因子β1(TGFβ1)

苦参碱(matrine)有明确的抗肝脏纤维化的作用，在治疗慢性肝炎和肝纤维化等方面已得到广泛应用。汤苏阳等研究证实苦参碱还对皮肤成纤维细胞活性有抑制作用〔1〕;付松泉等发现苦参碱对肺间质纤维化有很好的治疗效果〔2〕，但对于糖尿病肾病(DN)的作用国内外鲜见报道。本研究通过观察转化生长因子β1(TGFβ1)在DN 大鼠肾脏中的表达及其与肾脏结构和功能改变之间的关系，探讨苦参碱对肾脏保护作用的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 苦参碱，购自宁夏博尔泰利药业股份公司;链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司;肾组织转化生长因子(TGFβ1)兔抗鼠单克隆抗体及ABC法免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;血糖测定采用美国强生血糖仪;雄性Wistar大鼠，体重(267.6±12.3)g，由甘肃省肿瘤医学科学院动物实验中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 糖尿病(DM)动物模型制备及分组 36只清洁级雄性Wistar大鼠，随机分为正常对照组(NC)、DN模型组(DN)和苦参碱治疗组(MT)，每组12只。所有大鼠均经背部切口行右肾切除术。2 w后，DN组和MT组大鼠按60 mg/kg剂量1次性腹腔内注射STZ(溶于新鲜配制的0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，pH4.5)，制作DN大鼠模型。72 h后，尾静脉采血，以血糖≥16.7 mmol/L作为DN大鼠模型建立标准。NC组仅腹腔注射等量缓冲液。MT组大鼠成功建立DN模型后，用苦参碱注射液按100 mg·kg-1·d-1术后1 w腹腔注射;NC组和DN 模型组仅给予等量生理盐水腹腔注射。持续给药8 w后处死。所有大鼠自由饮水，每周称体重和测血糖，不使用任何降糖药。

　　1.2.2 观测指标及检测方法 所有大鼠剪断右股骨动脉取血测尿素氮(BUN)、肌酐(Cr);实验8 w时用代谢笼收集24 h尿液，用考马斯亮兰法测尿蛋白排泄量;大鼠处死后，迅速取出左肾，剥离被膜称重后，经肾门纵向剖开，一半以上的肾组织置于4%多聚甲醛液中常规固定、石蜡包埋，常规HE染色，并进行TGFβ1免疫组化分析。用Mias多功能真彩色病理图像分析系统对每张苏木素尹红(HE)染色切片随机测定30个肾小球截面积〔A(G)〕，根据公式V(G)=1.25×〔A(G)〕3/2，计算肾小球体积;免疫组化分析经图像冻结、光密度标定、图像分割，以平均吸光度值表示。

　　1.3 统计学处理 结果数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件的单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠一般情况及血糖、体重变化 大鼠成模后出现多食、多饮、多尿等代谢紊乱症状，并逐渐加重，体重下降，皮毛枯黄，行动迟缓，反应迟钝。DN和MT组血糖均较NC组明显升高(P<0.01)，苦参碱对血糖无显著影响。实验中，DN组死亡3只，MT组死亡2只。见表1。

　　2.2 苦参碱对DM大鼠肾脏结构和功能的影响 DN组大鼠HE光镜切片显示：肾小球肥大，毛细血管内皮细胞肿胀，系膜区扩大。DN和MT组肾小球体积(MGV)比NC组明显增大(P<0.01，P<0.05);BUN、Cr、尿蛋白明显升高(P<0.01，P<0.05)。MT组能使上述指标明显改善(P<0.01，P<0.05)。见表2。

　　2.3 苦参碱对肾组织TGFβ1表达的影响 DN和MT组肾组织TGFβ1的表达分别为0.832±0.163，0.294±0.089，与NC组(0.208±0.075)比较明显上调(P<0.01);与DN组比较，苦参碱能明显抑制TGFβ1表达(P<0.01)。见图1。表1 各组大鼠血糖、体重变化结果表2 苦参碱对DM大鼠MGV、血清BUN、Cr、尿蛋白的影响与NC组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与DN组比较：3)P<0.05，4)P<0.01图1 各组大鼠肾组织TGFβ1的表达(×400)

　　3 讨 论

　　DN早期的临床特征主要是尿微量白蛋白排泄率明显升高，病理改变是肾小球体积增大、肾小球毛细血管基底膜增厚和肾小球细胞外基质(ECM)增多。ECM沉积是DN特征性的病理改变，合成与降解失衡是造成ECM积聚的主要原因〔3〕。许多细胞因子参与了这一病理过程，并在DN 的发生发展过程中起着重要作用，其中TGFβ在ECM 的积聚中起关键作用〔4〕。

　　长期高血糖与DM慢性并发症有很大关系，单纯控制血糖水平并不能完全有效预防和治疗DN，在DN的治疗中，除积极控制血糖外，还应积极寻找有效药物。苦参系药用豆科槐属植物苦参的干燥根，性寒味苦，始载于我国最早的药学文献《神农本草经》。苦参碱是苦参型生物碱的主要活性成分，有多方面的药理作用和功效〔5〕。近年来，器官纤维化发生机制研究表明，尽管不同组织和器官纤维化的具体发生机制有些差别，但具有许多共性:器官纤维化以各种原因引起的实质细胞损伤为起点，继之有实质细胞的炎症变性、坏死，刺激相应的巨噬细胞(前炎症细胞)，释放多种细胞因子和生长因子等活性因子，后者激活静息状态的ECM产生细胞，使之转化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞增殖，分泌细胞因子，通过旁分泌方式再作用于巨噬细胞。肌成纤维细胞合成大量胶原等ECM成分，同时ECM降解减少，从而导致器官纤维化。纤维化性疾病的发生机制和过程具有一些基本的共同过程。在细胞水平和分子水平上纤维化形成过程十分相似，具有殊途同归的特点，提示对一种器官纤维化发生机制的研究结果，可能也适用于其他器官纤维化;对一种器官纤维化的有效治疗方法，对阻止其他组织器官纤维化也可能是有益的〔6〕。

　　本实验结果表明：DN 大鼠肾脏中细胞因子TGFβ1的表达明显增高，同时伴有肾脏结构与功能改变，说明在DN 早期，这些细胞因子生成增多，一方面促使肾小球体积增大、滤过面积增加，从而导致DN时肾小球高滤过的发生;另一方面，可造成ECM的大量沉积，致使肾小球滤过屏障受损而出现蛋白尿。苦参碱治疗组大鼠TGFβ1细胞因子表达较DN模型组则有明显下降，说明苦参碱可显著降低DN大鼠肾脏TGFβ1细胞因子的表达水平、减少ECM的沉积、缩小肾小球体积、减少尿白蛋白的排泄，从而起到较好的保护肾脏的作用。本实验为进一步开展DN的临床治疗提供更加详实、可靠的佐证。

参考文献

　1 汤苏阳，宝 仁，李荟元，等.苦参碱对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增生活性抑制作用〔J〕.中国临床康复，2002;6(4):5101.

　　2 付松泉，傅松波，杨欣嶙，等. 苦参碱对肺间质纤维化大鼠外周血单个核细胞DNA损伤的保护研究〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(24)：240912.

　　3 Eikmans M，Baelde JJ，de Heer E，et al.ECM homeostasis in renal diseases：a genomic approach〔J〕.J Pathol，2003;200(4):52636.

　　4 Hohenstein B，Daniel C，Hausknecht B，et al.Correlation of enhanced thrombospondin1 expression，TGFbeta signalling and proteinuria in human type2 diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2008;23(12):38807.

　　5 王俊学，王国俊.苦参碱及氧化苦参碱的药理作用及临床应用〔J〕.肝脏，2000;5(2):1167.

　　6 李 才.器官纤维化基础与临床〔M〕.北京:人民卫生出版社，2003：13853.

　　2.2 苦参碱对DM大鼠肾脏结构和功能的影响 DN组大鼠HE光镜切片显示：肾小球肥大，毛细血管内皮细胞肿胀，系膜区扩大。DN和MT组肾小球体积(MGV)比NC组明显增大(P<0.01，P<0.05);BUN、Cr、尿蛋白明显升高(P<0.01，P<0.05)。MT组能使上述指标明显改善(P<0.01，P<0.05)。见表2。

　　2.3 苦参碱对肾组织TGFβ1表达的影响 DN和MT组肾组织TGFβ1的表达分别为0.832±0.163，0.294±0.089，与NC组(0.208±0.075)比较明显上调(P<0.01);与DN组比较，苦参碱能明显抑制TGFβ1表达(P<0.01)。见图1。表1 各组大鼠血糖、体重变化结果表2 苦参碱对DM大鼠MGV、血清BUN、Cr、尿蛋白的影响与NC组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与DN组比较：3)P<0.05，4)P<0.01图1 各组大鼠肾组织TGFβ1的表达(×400)

　　3 讨 论

　　DN早期的临床特征主要是尿微量白蛋白排泄率明显升高，病理改变是肾小球体积增大、肾小球毛细血管基底膜增厚和肾小球细胞外基质(ECM)增多。ECM沉积是DN特征性的病理改变，合成与降解失衡是造成ECM积聚的主要原因〔3〕。许多细胞因子参与了这一病理过程，并在DN 的发生发展过程中起着重要作用，其中TGFβ在ECM 的积聚中起关键作用〔4〕。

　　长期高血糖与DM慢性并发症有很大关系，单纯控制血糖水平并不能完全有效预防和治疗DN，在DN的治疗中，除积极控制血糖外，还应积极寻找有效药物。苦参系药用豆科槐属植物苦参的干燥根，性寒味苦，始载于我国最早的药学文献《神农本草经》。苦参碱是苦参型生物碱的主要活性成分，有多方面的药理作用和功效〔5〕。近年来，器官纤维化发生机制研究表明，尽管不同组织和器官纤维化的具体发生机制有些差别，但具有许多共性:器官纤维化以各种原因引起的实质细胞损伤为起点，继之有实质细胞的炎症变性、坏死，刺激相应的巨噬细胞(前炎症细胞)，释放多种细胞因子和生长因子等活性因子，后者激活静息状态的ECM产生细胞，使之转化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞增殖，分泌细胞因子，通过旁分泌方式再作用于巨噬细胞。肌成纤维细胞合成大量胶原等ECM成分，同时ECM降解减少，从而导致器官纤维化。纤维化性疾病的发生机制和过程具有一些基本的共同过程。在细胞水平和分子水平上纤维化形成过程十分相似，具有殊途同归的特点，提示对一种器官纤维化发生机制的研究结果，可能也适用于其他器官纤维化;对一种器官纤维化的有效治疗方法，对阻止其他组织器官纤维化也可能是有益的〔6〕。

　　本实验结果表明：DN 大鼠肾脏中细胞因子TGFβ1的表达明显增高，同时伴有肾脏结构与功能改变，说明在DN 早期，这些细胞因子生成增多，一方面促使肾小球体积增大、滤过面积增加，从而导致DN时肾小球高滤过的发生;另一方面，可造成ECM的大量沉积，致使肾小球滤过屏障受损而出现蛋白尿。苦参碱治疗组大鼠TGFβ1细胞因子表达较DN模型组则有明显下降，说明苦参碱可显著降低DN大鼠肾脏TGFβ1细胞因子的表达水平、减少ECM的沉积、缩小肾小球体积、减少尿白蛋白的排泄，从而起到较好的保护肾脏的作用。本实验为进一步开展DN的临床治疗提供更加详实、可靠的佐证。

参考文献

　1 汤苏阳，宝 仁，李荟元，等.苦参碱对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增生活性抑制作用〔J〕.中国临床康复，2002;6(4):5101.

　　2 付松泉，傅松波，杨欣嶙，等. 苦参碱对肺间质纤维化大鼠外周血单个核细胞DNA损伤的保护研究〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(24)：240912.

　　3 Eikmans M，Baelde JJ，de Heer E，et al.ECM homeostasis in renal diseases：a genomic approach〔J〕.J Pathol，2003;200(4):52636.

　　4 Hohenstein B，Daniel C，Hausknecht B，et al.Correlation of enhanced thrombospondin1 expression，TGFbeta signalling and proteinuria in human type2 diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2008;23(12):38807.

　　5 王俊学，王国俊.苦参碱及氧化苦参碱的药理作用及临床应用〔J〕.肝脏，2000;5(2):1167.

　　6 李 才.器官纤维化基础与临床〔M〕.北京:人民卫生出版社，2003：13853.