依那普利对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞产生TGFβ1、LN及CTGF表达的影响

　　　　　　 作者：彭爽 曹文富 陈平 唐静

【摘要】 目的 观察依那普利(Enalapril，Ena)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)转化生长因子β1(TGFβ1)、层黏连蛋白(LN)及结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法 大鼠GMCs分别培养于正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)、高浓度葡萄糖(20 mmol/L)及高糖和不同浓度(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)的Ena中，同时设空白对照。分别采用放射免疫法、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同时间(24、48、72 h)细胞培养上清液中TGFβ1、LN含量，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测72 h细胞CTGF mRNA的表达。结果 与空白对照组比较，正常糖组和高糖组TGFβ1分泌增加、LN合成增多、CTGF表达上调(P<0.001)，高糖组更明显(P<0.001)。与高糖组比较，高、中、低浓度的Ena干预均可逆转上述变化。结论 高糖可致GMCs分泌TGFβ1增加、合成LN增多、CTGF表达上调，Ena可减少细胞外基质(ECM)积聚，下调CTGF表达，从而有利于延缓糖尿病肾病肾小球硬化(GS)的进展。

【关键词】 依那普利;肾小球系膜细胞;转化生长因子β1;层黏连蛋白;结缔组织生长因子

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of enalapril on the production of transforming growth factorβ1(TGFβ1)， laminin(LN) and connective tissue growth factor(CTGF) in rat glomerular mesangial cells(GMCs) cultivated under high glucose. Methods GMCs were cultured with normal concentration glucose(NG， 5.5 mmol/L)， high concentration glucose(HG， 20 mmol/L)， and HG plus different concentration of enalapril for different duration(24 h， 48 h， 72 h)， and blank control was set up simultaneously. The contents of TGFβ1， LN in the supernatant of cultured. GMCs were detected by RIA， ELISA， respectively， and the expression of CTGF was detected by RTPCR. Results Compared with those in blank control group， the contents of TGFβ1， LN were higher than those in NG and HG groups (P<0.001)， and the expression of CTGF was upregulated in NG and HG groups (P<0.001)， HG group was more significant(P<0.001). Compared with those in HG group， HG plus high， middle， low concentration of enalapril groups had significantly lower TGFβ1， LN in the supernatant of cultured GMCs(P<0.005)， and decreased the expression of CTGF. Conclusions GMCs can increase the secretion of TGFβ1， synthesis of LN， expression of CTGF induced by high glucose. Enalapril can reduce accumulation of extracelluar matrix(ECM)， and downregulate the expression of CTGF， then delay the progression of glomerular sclerosis of diabetic nephropathy.

　　【Key words】 Enalapril; Glomerular mesangial cell; Transforming growth factorβ1; Laminin; Connective tissue growth factor

　　糖尿病肾病(DN)早期高血糖即可引起肾小球系膜细胞(GMCs)增殖，过度增殖的GMCs产生和释放转化生长因子β1(TGFβ1)、结缔组织生长因子(CTGF)等多种致纤维化细胞因子(CK)，促进层黏连蛋白(LN)等细胞外基质(ECM)的过量生成和沉积，加剧肾小球损伤，并最终导致肾小球硬化(GS)、肾间质纤维化(RF)及终末期肾病(ESRD)的发生〔1，2〕。高血糖还可使肾脏局部血管紧张素(Ang)Ⅱ增加，后者可通过诱导氧化应激而促进GMCs增殖、ECM合成增加，促进GS的进程〔3〕。依那普利(Ena)为血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，抑制血管紧张素转换酶(ACE)，阻止AngⅠ向AngⅡ转化，降低AngⅡ含量，从而减少ECM积聚，阻止GS和RF的发生，延缓肾脏疾病的进展。但Ena能否抑制高糖诱导的大鼠GMCs产生TGFβ1、LN，下调CTGF表达，尚需进一步研究。本研究通过观察Ena对体外培养的大鼠GMCs产生TGFβ1、LN及CTGF表达的影响，探讨其延缓DN的GS可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与细胞 将马来酸Ena(原料药由常州制药厂惠赠，批号：090307)溶于加热的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)中，配制成1 mmol/L的母液，无菌过滤待用(4℃保存);大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY1)(武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，编号：GDC124);MEM培养液(Hyclone公司);胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程公司);胰蛋白酶(Gibco公司);乙二胺四乙酸(EDTA，Amresco公司);TGFβ1 酶联免疫法(ELISA)定量分析试剂盒(武汉博士德生物工程公司);LN放射免疫分析试剂盒(天津九鼎医学生物工程公司);RT试剂盒、RNAiso Plus、DNA Mraker(DL500)，均购自TaKaRa公司;2×Taq PCR MasterMix(KT201 天根生化科技公司);PCR引物(Invitrogen公司合成);多功能酶标仪(SpectraMax M2 美国MD公司);DFM96型多管放射免疫计数器(合肥众成机电技术公司);DYY6C型电泳仪(北京六一仪器厂);PCR仪、凝胶成像仪(美国BioRad公司);721型紫外分光光度计(上海浦光物理光学仪器厂)。

　　1.2 大鼠GMCs培养 肾小球骨母细胞系(HBZY1)细胞常规培养于含10% FBS的MEM培养液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培养。当细胞生长至90%贴壁时，即用0.1%胰蛋白酶+0.01% EDTA消化细胞、传代，1～2 d传代1次。

　　1.3 试验分组 取4～8代试验用GMCs进行试验分组。空白对照组：葡萄糖0 mmol/L;正常糖(NG)组：葡萄糖5.5 mmol/L;高糖(HG)组：葡萄糖20 mmol/L;HG+低浓度Ena组：葡萄糖20 mmol/L+Ena 10-7mol/L;HG+中浓度Ena组：葡萄糖20 mmol/L+Ena 10-6mol/L;HG+高浓度Ena组：葡萄糖20 mmol/+Ena 10-5mol/L。

　　1.4 培养上清液中TGFβ1、LN含量测定 取对数生长期系膜细胞，消化后制成单个细胞悬液，显微镜下血球计数板计数，按0.88×104/孔密度均匀接种于96孔培养板中，每孔培养液总量为200 μl，置于37℃、5% CO2孵箱中培养24 h，待细胞生长至90%融合时，弃上清，换成无血清的MEM培养液孵育24 h，使细胞同步于静止期(G0期)，弃上清，以含10% FBS的MEM培养液为基础培养液，按上述实验分组继续培养，每组设4个复孔。分别在培养的24、48、72 h收集细胞培养上清液，-20℃保存。按照TGFβ1 ELISA定量分析试剂盒、LN放射免疫分析试剂盒说明书分别进行TGFβ1、LN含量测定。试验重复3次。

　　1.5 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定CTGF mRNA的表达 取对数生长期GMCs，消化后制成单个细胞悬液，显微镜下血球计数板计数，按1.65×105个/ml密度接种于25 ml培养瓶中，每瓶培养液总量为5 ml，置于37℃、5% CO2孵箱中培养24 h，待细胞生长至90%融合时，弃上清，换成无血清的MEM培养液孵育24 h，使细胞同步于静止期(G0期)，弃上清，以含10% FBS的MEM培养液为基础培养液，按上述实验分组继续培养72 h，每24 h换液1次，4瓶细胞作为一组。于培养终点以RNAiso Plus试剂一步法提取各组细胞总RNA，用紫外分光光度计测定其纯度和含量，以2 μg总RNA为模板逆转录合成cDNA。根据文献合成CTGF和βactin寡核苷酸引物，CTGF：上游5′GTCTCTTCTGCGACTTCGGC3′;下游5′ACACACCCACTCCTCACAGC3′，扩增片段长度为263 bp。βactin：上游5′GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC3′;下游5′CATCTGCTGGAAGGTGGACA3′，扩增片段长度为452 bp。以50 μl体系进行PCR扩增反应，反应条件为：①预变性：94℃3 min;②PCR扩增：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环;③72℃延伸10 min。取2.5 μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶(含0.8 μl GoldView)电泳30 min，紫外灯下照相，用QuantityOne图像分析软件进行辉度扫描，以βactin辉度值为内参照进行标准校正，作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。

　　1.6 统计学分析 数据采用x±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度Ena对高糖培养的GMCs培养上清液中TGFβ1、LN含量的影响 与空白对照组比较，正常糖和高糖刺激24 h均可明显促进GMCs分泌TGFβ1、LN增加(P<0.001)，一直持续到48 h后。与正常糖比较，高糖的刺激作用更明显(P<0.001)。与高糖组比较，高、中、低浓度Ena作用24 h均能显著抑制高糖刺激的GMCs合成分泌TGFβ1、LN(P<0.005)。随着时间的延长，三组的抑制作用均有所加强，但三组之间没有统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 不同浓度Ena对高糖培养的GMCs培养上清液中TGFβ1、LN含量的影响与空白对照组比较：1)P<0.001;与NG组比较：2)P<0.001;与HG组比较：3)P<0.005

　　2.2 不同浓度Ena对高糖培养的GMCs CTGF mRNA表达的影响 空白对照组CTGF mRNA表达量为0.172±0.364，正常糖和高糖刺激72 h均可明显促进GMCs表达CTGF mRNA增加(分别为0.41±0.338，1.253±0.269)(P<0.001)。与正常糖比较，高糖的刺激作用更明显(P<0.001)。与高糖组比较，高、中、低浓度Ena作用72 h均能显著抑制高糖刺激的GMCs表达CTGF mRNA(分别为0.562±0.445，0.678±0.239，0.835±0.351)(P<0.005)，但三组之间没有统计学意义(P>0.05)。见图1。

　　3 讨 论

　　糖尿病状态或高糖可激活GMCs，使其明显增殖，产生和释放TGFβ1、CTGF等多种CK，进而使ECM大量产生和积聚。ECM主要由Ⅳ型胶原(ColⅣ)、LN、纤维连接蛋白(FN)、唾液酸和蛋白多糖组成，其在肾小球基底膜(GBM)区进行性积聚是导致GS的主要原因之一。LN又称为Ⅳ型胶原基质，属结构性糖蛋白，在基底膜中借短臂与ColⅣ结合，借长臂与硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合，共同维持GBM功能。Mariappan等〔4〕的研究表明，高糖可通过调节LNβ1 mRNA翻译过程迅速诱导鼠类肾脏近端小管上皮细胞LNβ1合成。TGFβ1是GMCs分泌的、被公认为导致ECM积聚的重要CK，能刺激GMCs增殖，增加ECM蛋白(如ColⅣ、FN、LN及某些蛋白聚糖)的合成和堆积，在肾小球炎症和GS发展过程中起着重要作用。高糖环境下，TGFβ1合成增加，生物活性持续增强。TGFβ1还能通过抑制蛋白水解酶的合成、促进金属蛋白酶组织抑制剂的生成，减少异常合成的ECM降解，从而加重ECM在GBM区的沉积。CTGF被普遍认为是TGFβ1的重要下游介质，介导TGFβ1促进ECM积聚的负面效应，其异常表达在RF过程中起着重要作用〔5～7〕。CTGF上调通常发生在以ECM增生和纤维化病变为特征的肾小球疾病，包括DN〔8〕，其升高程度与GS、肾小管间质纤维化的程度密切相关。本课题的前期研究发现，中药复方能通过下调链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织CTGF的表达而起到肾保护作用〔9〕。

　　在糖尿病高血糖状态下，肾内肾素血管紧张素系统被不适当激活，ACE活性增高，AngⅡ表达增多，直接参与对肾脏的进行性损害。AngⅡ参与了GMCs增殖的过程，造成ECM大量生成和积聚，并作为促生长因子而刺激TGFβ1、CTGF等多种CK的产生，加速GS发展。Ena为含有羧基、作用持久的ACEI，通过强烈抑制ACE，进而抑制AngⅡ形成，使血液和组织中的AngⅡ减少，从而对抗AngⅡ的肾损害作用，减轻GS进程。

　　本研究结果表明，正常糖和高糖刺激24h均能明显促进GMCs分泌合成TGFβ1、LN增加，这种作用一直持续到48 h后，两者刺激72 h后均能明显促进GMCs表达CTGF增加，而高糖的刺激作用更明显。说明高糖通过促进TGFβ1、LN合成与分泌增多，上调CTGF表达，促进了DN的GS发生与发展。随着时间的延长，TGFβ1、LN的增加在72 h并没有表现出持续增加，而是降低到24 h与48 h之间的水平，推测这可能与GMCs自身代谢逐渐增加、营养成分(包括糖)逐渐消耗以及期间可能出现的其他情况有关。高、中、低浓度Ena作用72 h均能显著抑制高糖刺激的GMCs表达CTGF，且依次有减弱的趋势，但三组之间没有统计学意义，而作用24 h均能显著抑制高糖刺激的GMCs合成分泌TGFβ1、LN。推测这与Ena抑制AngⅡ形成，使细胞培养液中AngⅡ水平下降，并部分抑制高糖的刺激作用有关。随着时间的延长，高、中、低浓度Ena对GMCs合成分泌TGFβ1、LN的抑制作用有加强的趋势，但三组之间及组内不同时间之间均无统计学意义，原因可能与各浓度间的倍比率不够大、样本量不够多等有关。本研究发现，Ena可显著抑制高糖诱导的体外培养的GMCs产生TGFβ1、LN，下调CTGF表达，提示其具有延缓DN的GS进展作用。但Ena减少ECM积聚、下调CTGF表达的机制尚待进一步研究。

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