雷米普利对心肌梗死后心衰大鼠非梗死区胶原的抑制作用

　　　　 作者：魏群 杨杰 赵东明 宋显晶 杨萍

【摘要】 目的 研究心肌梗死后心衰大鼠非梗死区心肌血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)及其Ⅰ型受体(AT1R)表达对心室重构的影响及雷米普利的干预作用。方法 结扎大鼠左冠状动脉前降支并饲养6 w的16只存活大鼠，随机分为模型组及雷米普利组，每组8只，另取8只大鼠为假手术组，连续灌胃给药4 w后测定大鼠血流动力学参数，ELISA方法检测血清及左心室非梗死区AngⅡ的含量，RTPCR 法测定左心室非梗死区心肌组织AT1R mRNA表达水平，Masson染色观察非梗死区心肌胶原的沉积。结果 雷米普利能明显升高左心室内压最大上升和最大下降速率(±dp/dtmax)，降低左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)(P<0.05或P<0.01)，但对心率(HR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)无明显影响(P>0.05)，同时明显降低血清及左心室非梗死区AngⅡ的含量及下调AT1R mRNA 表达水平(P<0.01或P<0.001)，Masson染色可见非梗死区心肌胶原沉积明显减轻。结论 雷米普利对梗死后心衰大鼠非梗死区心肌间质胶原重构有显著的抑制作用，其作用机制与下调AT1R表达水平及减轻胶原沉积有关。

【关键词】 雷米普利;大鼠;心衰;血管紧张素Ⅱ受体1

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of Ramipril on the content of angiotensin Ⅱand the expression of AT1R mRNA in heart failure rats after acute myocardial infarction (AMI) in noninfarction zone(NIZ).Methods The rat models of heart failure were established by left anterior descending coronary artery deligation. After 6 w， 24 surviving rats were pided into sham，model and Ramipril groups at random，8 rats in each，and were treated with medicines by intragastric administration respectively. At 10 w， left ventricular enddiastolic pressure (LVEDP)， left ventricular systolic pressure(LVSP)， +dp/dtmax anddp/ dtmaxof left ventricular pressure were measured. In addition， the contents of Ang Ⅱ in serum and in noninfarction zone were quantified with ELISA， the expression of AT1R mRNA was detected by RTPCR in NIZ. Furthermore， myocardial pathological changes were observed by light microscope after Masson dyeing. Results Ramipril decreased significantly LVSP and LVEDP， the contents of AngⅡ in serum and in noninfarction zone， downregulated AT1R mRNA expression in NIZ(P<0.05～0.01)，whereas increased ±dp/dtmax(P<0.05～0.01)， lightened collagen deposition in NIZ with Masson dyeing， but no influence on HR， SBP and DBP(P>0.05). Conclusions Ramipril inhibit myocardial interstitial collagen reconstitution on heart failure after AMI， which may be related to downregulating AT1R mRNA expression and lightening collagen deposition in NIZ in the development heart failure.

　　【Key words】 Ramipril; Rats; Heart failure; AT1receptor

　 心室重构是心肌走向衰竭的始动因素，其肥厚是重要的表征性变化，逆转左心室重构是遏制疾病进展的重要环节。1993年Sadoshima等在培养的心肌细胞中发现，心肌肥厚过程中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)起重要的介导作用〔1〕，AngⅡ的作用是通过其特异受体介导的，已知其受体亚型有AngⅡ1型(AT1)和AngⅡ2型(AT2)两种。既往的研究发现卡托普利在急性心肌梗死(AMI)后对心脏有保护作用，可以减少心室扩张、室间隔肥厚和非梗死组织的纤维化，这些作用可能与其明确的抗循环中AngⅡ相关〔2〕。但随着对肾素血管紧张素醛固酮系统(RAS)的深入研究，认为亲组织型的转换酶抑制剂(ACEI)对防止心肌重构的作用更好，特别是ACEI对AMI后心衰非梗死区的作用备受关注，而AMI后非梗死区的AT1受体(AT1R)mRNA 表达情况及ACEI对此是否有影响尚少报道。本实验观察了AMI后心衰动物模型中非梗死区心肌重构的形态学改变、AT1R表达水平的变化及雷米普利研究干预作用，探讨雷米普利抗实验性心衰的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 Wistar大鼠，30只，体重200～220 g，雌性，合格证号：SCXK(吉)20030001由吉林大学实验动物中心提供。

　　1.2 药品和试剂 雷米普利由北京安万特制药有限公司提供，批号:C7002，溶于0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)中;AngⅡELISA测定试剂盒均由美国ADL公司提供。

　　1.3 动物模型 大鼠左冠脉结扎参照文献〔3〕方法，乙醚吸入麻醉后，仰卧位固定于手术台，剪去胸前鼠毛，75%酒精消毒，先用10号缝线在开胸部位做一荷包，自左侧3～4肋间开胸，打开心包膜，暴露心脏，模型组(21只)于左冠状动脉前降支，以0号线结扎冠脉，假手术组(9只)仅穿线不结扎，术后将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内的血液和气体，迅速收拢荷包关闭胸腔，整个开胸时间不超过30 s。术后常规给予腹腔注射青霉素20万U/kg抗炎7 d。冠脉结扎术后48 h死亡4只大鼠，1 w内死亡1只大鼠。从术后第2周至实验结束无大鼠死亡。假手术组1只大鼠死于麻醉意外。

　　1.4 分组及给药 将6 w后存活的16只模型组Wistar大鼠又随机分为模型组及雷米普利组，每组8只。药物组灌胃给予雷米普利3 mg/kg，假手术组及模型组均灌胃给予0.5%CMC。各组分别于术后第7周开始给药，连续给药4 w，每日1次，灌胃容积均为10 ml/kg。

　　1.5 指标测定 血流动力学参数测定:给药4 w后，各组大鼠称量体重后以3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定后分离右侧颈总动脉，行左心室插管，与RM6000型多道生理记录仪连接，稳定20 min后测量LVSP、LVEDP、±dp/dtmax，同时分离股动脉，插管测SBP及DBP，并同步记录HR。血流动力学参数测定后，腹主动脉取血3 ml，2 500 r/min离心10 min，取血清，置于-70℃。按ELISA试剂盒方法测血清AngⅡ含量(ng/ml);取血完毕，打开胸腔摘取心脏，沿左室长轴中点处垂直于长轴将左室一分为二，心尖侧一半非梗死区心肌组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片厚5 μm，行Masson染色。切取左室近心底部非梗死区心肌组织置于-70℃保存，用于心肌组织AngⅡ的测定及AT1R mRNA的检测。

　　1.6 AT1R mRNA表达水平的测定 每只动物取约50 mg心肌标本，加入0.5 ml Trizol，经氯仿、异丙醇提取总RNA。紫外分光光度计分析RNA的量和纯度。取2 μg总RNA逆转录合成cDNA，-20℃保存。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。βactin 基因的引物：正义GCTCGTCGTCGACAACGGCTC，反义CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC，片段长度359 bp;AT1R基因的引物序列：正义AGCGTCTTTCTTCTCAATCTCG，反义CCAGAAAGCCGTAGAACAGAG，片段长度726 bp。PCR反应:取3 μl逆转录产物分别进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性90 s，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，循环32次，最后72℃延伸10 min。取5 μl PCR反应产物进行1.5%琼脂糖电泳，光密度扫描后图片经Image J 软件分析，结果以检测蛋白/βactin的光密度比值表示。

　　1.7 ELISA法检测大鼠心肌组织中AngⅡ水平 首先提取心肌组织总蛋白。取实验大鼠非梗死区心肌组织50 mg，加入0.5 ml组织裂解缓冲液(1%Triton X100，pH7.5，50 mmol/L TrisHCl;150 mmol/L NaCl;2 mmol/L EDTA;2 mmol/L PMSF;1 mmol/L NaF;4 μg/ml leupeptin;1 μg/ml aprotitin)，0℃组织匀浆，以2 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液再以12 000 r/min 4℃离心30 min，回收上清液。应用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中蛋白水平。检测具体操作步骤严格按照大鼠AngⅡ ELISA试剂盒说明书进行，并计算出心肌组织匀浆上清中AngⅡ(ng/mg prot)的含量。血清中AngⅡ水平检测具体操作步骤也严格按照大鼠AngⅡ的ELISA试剂盒说明书进行。

　　1.8 统计学方法 实验数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件进行t检验。应用oneway ANOVA方差分析，多组间的相关性比较采用t检验，多组间的两两比较采用费希尔的LSD法。

　　2 结 果

　　2.1 Masson染色结果 假手术组：心肌细胞排列整齐，间质无明显可见绿色胶原纤维。模型组：非梗死区大量心肌细胞被胶原纤维代替，残留心肌数目少，心肌细胞排列紊乱、肥大。雷米普利组：非梗死区心肌细胞肥大，较少部分被胶原纤维代替，胶原纤维呈分枝状与心肌细胞相间，程度比模型组轻。见图1。表1 雷米普利对心梗后心衰大鼠血流动力学的影响与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

　　2.2 雷米普利对心衰大鼠血流动力学的影响 由表1可见，与假手术组比较，模型组SBP、DBP、LVSP、±dp/dtmax均明显下降，而LVEDP则明显增加(P<0.05或P<0.01)，表明大鼠AMI后心衰时左心收缩和舒张功能均明显受损。与模型组比较，雷米普利组能明显升高±dp/dtmax，降低LVEDP及LVSP(P<0.05或P<0.01)，而对HR、SBP、及DBP均无明显影响。表明雷米普利能明显改善AMI后心衰大鼠的左心收缩和舒张功能。

　　2.3 雷米普利对心衰大鼠AngⅡ含量及非梗死区心肌AT1R mRNA表达水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血清及左心室非梗死区AngⅡ的含量及非梗死区AT1R mRNA表达水平明显增高(P<0.01或P<0.001)。与模型组相比，雷米普利组能明显降低血清及左心室非梗死区AngⅡ的含量、下调非梗死区心肌AT1R mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。见表2。表2 雷米普利对AMI后心衰大鼠非梗死区心肌AT1R mRNA表达水平及AngⅡ含量的影响与假手术组比较：1)P<0.01，2)P<0.001;与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

　　3 讨 论

　　AMI后心脏发生修复性纤维化和反应性纤维化等胶原网络重构改变，参与心力衰竭的发生、发展。在心室重构过程中，RAS起着极为重要的作用〔4，5〕。RAS是一个复杂的调节系统，在哺乳动物维持血压稳态以及水、电解质平衡中发挥重要作用，也是心衰发生发展的关键环节，不但影响梗死区的重构，对非梗死区的重构也有重要的影响。心肌坏死和负荷的增加触发细胞内生化反应和信号传导增强， 可促进和调节修复过程，包括扩张、肥大和胶原瘢痕的形成。心肌肥大的促发是由于神经内分泌激活，心肌细胞本身伸长，局部组织RAS激活和一些旁分泌/自分泌因素所致。AMI后低血压可刺激肾素血管紧张素醛固酮轴儿茶酚胺分泌，交感神经末梢释放冲动和利钠肽分泌。丝氨酸蛋白酶激活非梗死区心肌的局部RAS系统，使局部血管紧张素转换酶(ACE)活性增强，局部Ang的分泌增加，导致非梗死区心肌肥大〔6〕。AMI后胶原沉积不但出现在梗死区瘢痕组织，同时在左室非梗死区——远离梗死区的心肌组织亦存在胶原增生〔7〕，并且非梗死区重塑是心室重塑的重要内容〔8〕。因此，AMI后心室重构过程中抑制RAS激活尤为重要，并且RAS系统抑制不单针对梗死区，对非梗死区也很重要。

　　本实验观察到模型组血清及非梗死区心肌局部组织AngⅡ含量明显升高，并与非梗死区胶原沉积一致。应用雷米普利后在降低外周及局部AngⅡ含量的同时，减轻了非梗死区胶原的沉积。进一步验证了心衰后心脏局部RAS系统激活，在非梗死区心室重构及胶原沉积中起着重要调控作用。持续高水平的AngⅡ是促进胶原生成和成熟的重要机制，是导致心肌纤维化和心脏左室重构进行性发生的重要原因〔9〕。离体实验已证实，AngⅡ可使培养的心脏成纤维细胞(FBC) 增生，高浓度AngⅡ可使FBC合成胶原增加，当加入AT1R的拮抗剂DVP后，FBC合成胶原能力下降，说明AngⅡ受体通过AT1促使FBC合成胶原〔10〕。另有研究认为在心肌肥厚的形成过程中，内源性RAS被激活使心肌中AngⅡ的合成增多，同时心肌中AT1R的转录和表达也发生明显变化〔11〕。本次实验的结果发现，AMI后心衰模型组AT1R mRNA表达水平较假手术组升高，给予雷米普利后AT1R mRNA表达水平下调。

　　雷米普利是新一代强效和长效的ACEI，因有高度亲脂性和与ACE结合的高度亲和性，故其对组织渗透力强，容易进入心脏、血管壁和肾脏等靶器官。目前ACEI已成为治疗高血压的一线药物，尤其雷米普利较其他ACEI抑制剂效果更佳。研究证实雷米普利可显著降低外周血清及非梗死区心肌组织中AngⅡ水平，减轻非梗死区心肌胶原沉积。雷米普利干预抑制AngⅡ生成的同时，也下调了心肌细胞 AT1R的表达，从而在配体和受体水平同时降低了AngⅡ的效应，这可能是ACEI类制剂抑制心室重构、改善心衰的主要机制。

参考文献

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　　8 Beltrami CA，Finato N，Rocco M，et al.Structural basis of endstage failure in ischemic cardiopathy in humans〔J〕.Circulation，1994;89(1):15163.

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　　11 Booz GW，Baker KM.Role of type Ⅰ angiotensin receptors in angiotensin induced cardiomyocyte hypertrophy〔J〕.Hypertension，1996;28(4):635.