作者：石玥，乔伟丽，王光明，吴金霞，闫长栋，张建福
【摘要】 目的 模拟缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型，观察再灌注不同时间点胃黏膜上皮细胞凋亡情况并分析其规律。方法 采用人胃黏膜上皮细胞株进行体外培养并传代，细胞以缺氧(5% CO2、1% O2、94% N2)+无糖KR液模拟缺血、缺氧，复氧、复糖模拟再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，用流式细胞仪、Hoechst33258染色法观察正常对照组及模拟损伤组于模拟缺血1 h，再灌注3、6、12 h细胞凋亡的情况及变化规律。结果 ①胃黏膜上皮细胞12～24 h贴壁，24 h后有少量上皮样细胞从周边爬出，48 h后细胞呈指数样生长，72 h后细胞已基本能达到融合。②模拟胃缺血/再灌注后细胞凋亡率于缺血1 h、再灌注6 h时出现高峰，且与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。经Hoechst33258染色，荧光显微镜下观察可见细胞于缺血1 h、再灌注6 h时产生典型的凋亡形态学变化如核浓染、核碎裂、边集等。结论 成功模拟了缺血/再灌注诱导人离体的胃黏膜上皮细胞损伤模型;该损伤模型可引起胃黏膜上皮细胞的凋亡，且在缺血1 h、再灌注6 h时为高峰。
【关键词】 胃缺血/再灌注;胃黏膜上皮细胞;细胞凋亡;细胞培养
Abstract: Objective To simulate the ischemia/reperfusion-induced injury to the epithelial cells of gastric mucosa and to investigate the cellular apoptosis at different time points in order to explore its regularity.Methods Human gastric epithelial cell line was cultured and subculture in vitro. The cells were subjected to hypoxia (5% CO2， 1% O2 and 94% N2) + glucose-free KR bicarbonate buffer and succedent reperfusion (5%CO2 and 95% air) in DMEM/F12 to simulate conditions of ischemia and hypoxia， reoxygenation and glucose reintroduction. The morphological changes and the percentage of apoptotic cells were evaluated by Hoechast33258 staining， flow cytometry (FCM) at reperfusive 3， 6 and 12 h secondary to 1 h simulated ischemia culture.Results ①Observation under the inverted microscope revealed the gastric mucosa epithelial cell adherence after 12 to 24 h; and at 24th h， there was outgrowth of epithelial cells; at 48th h the cells were in exponential growth; and at 72nd h the cultured cells reached nearly confluence， displaying the typical cobblestone appearance. ②FCM analysis revealed that the percentage of cell apoptosis peaked at simulated ischemic 1 h and reperfusive 6 h， with significant difference (P<0.01) compared with control group. Hoechst33258 staining and fluorescent microscopy revealed typical morphological changes of apoptotic cells including hyperchromatic nuclei， karyorrhexis， margination， etc. at ischemic 1 h and reperfusive 6 h.Conclusion The ischemia/reperfusion-induced apoptosis of human gastric mucosal epithelial cells cultured in vitro was successfully simulated. This injury model is able to induce apoptosis of gastric mucosal epithelial cells with a peak at the time point of reperfusive 6th h secondary to ischemic 1st h.
Key words：gastric ischemia-reperfusion; gastric mucosa epithelial cell; cell apoptosis; cell culture
胃缺血/再灌注(gastric ischemia-reperfusion， GI/R)损伤是一种常见的临床病理生理过程，临床发生多器官障碍综合征时，由于血液的重分布造成的胃肠黏膜缺血出现的最早最明显，远比其他脏器更易发生缺血-再灌注损伤，因此，胃被认为是机体内最早受累的器官[1-2]。胃黏膜虽易损伤，但其修复快，它是机体内自身代谢最快的组织之一，这表明胃黏膜细胞可能具有较强的抗凋亡调控机制和增殖修复能力。深入研究GI-R的胃黏膜上皮细胞凋亡、增殖及其分子机制不仅有利于GI-R的防治，而且对于器官缺血/再灌注损伤理论的深入具有重要意义。
以往研究多是采用夹闭腹腔动脉导致胃缺血/再灌注损伤的在体模型[3-4]，但由于体内环境的复杂性，在体研究受到诸多因素的干扰，也难以特异性地针对胃黏膜某一细胞进行研究。故对于离体胃黏膜上皮细胞缺血-再灌注后损伤的研究具有十分重要的意义。本研究采用人胃黏膜上皮细胞株经体外培养及传代后建立模拟缺血/再灌注细胞损伤模型，观察在缺血-再灌注不同时间点胃黏膜上皮细胞凋亡的情况及其规律。
1 材料和方法
1.1 实验试剂及细胞株 DMEM/F12(1∶1)培养基购自美国Hyclone公司;Hoechst33258、碘化吡啶(PI)染液购自美国Sigma公司;人胃黏膜上皮细胞株由北京肿瘤研究所提供。
1.2 实验分组
1.2.1 正常对照(control)组 正常环境下培养人胃黏膜上皮细胞。
1.2.2 模拟缺血/再灌注损伤(I-R)组 更换模拟缺血液，于缺氧箱中缺氧、缺糖孵育1 h，更换模拟再灌注液，正常环境下分别进行再灌注孵育3、6、12 h。
1.3 模拟缺血-再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡模型的建立 采用缺氧、缺糖、复氧、复糖的方法模拟在体的缺血/再灌注过程。参照文献的方法[5-6]，取胃黏膜上皮细胞接种在培养瓶中，待细胞生长至2～3天接近融合状态时，将上述培养基置换为无糖的模拟缺血液，在模拟缺血条件下(5% CO2、1% O2、94% N2、37℃的缺氧箱中缺氧、缺糖)培养1 h，之后将模拟缺血液吸尽并加入正常DMEM/F12(含10%的胎牛血清)培养基，放至普通培养箱中(5% CO2、37℃)继续培养不同时间。
1.4 流式细胞仪分析细胞凋亡率 分别收集各组培养的胃黏膜上皮细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用0.25%胰酶消化液制备单细胞悬液，以75%冷乙醇固定，置4℃ 保存。向固定的细胞悬液中加入PBS，轻轻混匀，1 000 r/min离心5 min，去除固定液。再以PBS洗一次。加入RNase A和PI染色液4℃避光染色30 min后，用流式细胞仪检测分析细胞DNA含量，计算凋亡细胞百分率和凋亡峰，此峰的大小即代表凋亡细胞的多少。
1.5 胃黏膜上皮细胞形态学观察 Hoechst33258染色法：吸尽培养液，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定细胞10 min;去除固定液，用MPBS洗2次;加入0.5 ml Hoechst33258染色液(10 mg/L) 37℃染色15 min;去染色液，用MPBS洗2次，去除过多的染色背景;荧光显微镜下观察(激发波长为350 nm，发射波长为460 nm)，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染为凋亡阳性细胞。
1.6 统计学处理 数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为有显著性差异。
2 结 果
2.1 胃黏膜上皮细胞的培养及传代 倒置显微镜下观察，胃黏膜上皮细胞12～24 h贴壁，24 h后可见少量上皮样细胞从周边爬出，48 h后见细胞呈指数样生长，72 h后细胞已基本融合，镜下观察可见细胞体积较大，细胞间紧密相连融合成片，核椭圆形，呈多边鹅卵石铺路样(图1)。传代后的细胞生长迅速，48～72 h后可传代。表明本研究中胃黏膜上皮细胞的体外培养及传代成功可行。图1 倒置显微镜下观察正常对照组细胞
A.Bar=40 μm; B.Bar=20 μm2.2 模拟缺血-再灌注损伤对胃黏膜上皮细胞凋亡的影响
2.2.1 流式细胞仪检测模拟缺血/再灌注后不同时间点细胞凋亡率变化 经流式细胞仪分析细胞的DNA含量。正常对照组胃黏膜上皮细胞凋亡百分率为(1.65±0.37)%，缺血/再灌注损伤组的胃黏膜上皮细胞经模拟缺血1 h，再灌注3、6、12 h均可诱导出凋亡峰(图2)，细胞凋亡百分率分别为 (2.34±0.27)%、(6.68±0.56)%、(2.84±0.68)%，其中再灌注6 h时细胞凋亡出现高峰，且凋亡率与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。图3。图2 流式细胞仪分析模拟缺血/再灌注后不同时间点细胞凋亡的情况
A.正常对照组;B、C、D.缺血1 h再灌注3、6、12 h组
图3 模拟缺血/再灌注不同时间点细胞凋亡率的比较
与正常对照组比较：# # P<0.01 (n=5)2.2.2 凋亡形态学检测结果 胃黏膜上皮细胞经模拟缺血-再灌注后，镜下观察其形态学变化:正常对照组的细胞呈铺路石状排列，细胞为扁平多角型，细胞间紧密相连，核呈圆形或椭圆形(图4A、4B);经模拟缺血1 h再灌注3、6、12 h处理后，细胞体积、细胞间隙均明显增宽，部分细胞脱落，其中以再灌注6 h细胞凋亡最为明显(图4C、4D)。胃黏膜上皮细胞经缺血1 h、再灌注6 h处理后，经Hoechst33258染色，在荧光显微镜下观察可见胃黏膜上皮细胞产生典型的凋亡形态学变化如核浓染、核碎裂、边集等(图5)。图4 胃黏膜上皮细胞经模拟缺血/再灌注后镜下形态学变化
A、B.正常对照组(A：Bar=40 μm;B： Bar=20 μm);C、D.模拟缺血1 h、再灌注6 h组(C：Bar=40 μm; D：Bar=20 μm)图5 荧光显微镜下胃黏膜上皮细胞的形态学变化(Hoechst33258染色)
A.正常对照组;B.模拟缺血1 h、再灌注6 h组(Bar=20 μm)
3 讨 论
本实验从形态学方面观察到了模拟缺血/再灌注损伤后胃黏膜上皮细胞凋亡的变化：出现典型凋亡特征。同时，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量，观察模拟缺血/再灌注后不同时间点细胞凋亡率的变化。细胞发生凋亡时，由于核酸内切酶的激活，细胞内的DNA发生了断裂， DNA含量减少，与荧光染料PI的结合减少，细胞的DNA荧光强度会降低，分析图上在G0/G1峰前出现DNA含量减少的亚G0/G1峰，即典型的凋亡峰[7]。实验结果表明：在缺血1 h、再灌注6 h后细胞凋亡出现明显的高峰，细胞损伤加重。我们推测胃黏膜上皮细胞于缺血1 h、再灌注6 h后明显凋亡可能与其具有较强的凋亡调控机制和增殖修复能力有关。
缺血/再灌注损伤导致的胃黏膜上皮细胞损伤实际上是一种氧化应激反应，在缺血-缺氧、氧自由基(OFR)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等胞外刺激信号的作用下，可激活核因子-κB(NF-κB)信号蛋白通路。然而NF-κB 在各类细胞中所导致的生物学反应是不同的，在一些细胞内它可以引起细胞的增殖， 相反则促进了细胞的凋亡[8]。我们前期的研究表明：氧自由基和 NF-B的活化均参与 GI-R损伤过程[9-10]，因此，进一步研究缺血-再灌注损伤导致的胃黏膜上皮细胞凋亡机制，NF-κB在离体胃黏膜上皮细胞的缺血-再灌注损伤中将起什么作用是我们今后研究的重点，这对于防治器官缺血/再灌注损伤也有着重要的意义。
参考文献
[1] Kwiecień S， Brzozowski T， Konturek SJ. Effects of reactive oxygen species action on gastric mucosa in various models of mucosal injury [J]. J Physiol Pharmacol，2002，53(1):39-50.
[2] Synnerstad I， Johansson M， Nylander O， et al. Intraluminal acid and gastric mucosal integrity: the importance of blood-borne bicarbonate [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001，280(1):G121-129.
[3] Zhang JF， Zhang YM， Yan CD， et al. Neuroregulative mechanism of hypothalamic paraventricular nucleus on gastric ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Life Sci，2002，71(13):1501-1510.
[4] Zhang JF， Zheng F. The role of paraventricular nucleus of hypothalamus in stress-ulcer formation in rats [J]. Brain Res，1997，761(2):203-209.
[5] Zhang X， Shan P， Alam J， et al. Carbon monoxide modulates Fas/Fas ligand， caspases， and Bcl-2 family proteins via the p38alpha mitogen-activated protein kinase pathway during ischemia-reperfusion lung injury [J]. J Biol Chem，2003，278(24):22061-22070.
[6] Song JJ， Lee YJ. Daxx deletion mutant (amino acids 501-625)-induced apoptosis occurs through the JNK/p38-Bax-dependent mitochondrial pathway [J]. J Cell Biochem，2004，92(6):1257-1270.
[7] Bortuzzo C， Hanif R， Kashfi K， et al. The effect of leukotrienes B and selected HETEs on the proliferation of colon cancer cells [J]. Biochim Biophys Acta，1996，1300(3):240-246.
[8] Monaco C， Paleolog E. Nuclear factor kappaB: a potential therapeutic target in atherosclerosis and thrombosis [J].Cardiovasc Res，2004，61(4):671-682.
[9] 徐明，张建福，张咏梅.核因子κ B在大鼠胃缺血再灌注损伤中的表达及意义 [J]. 徐州医学院学报，2006，26(6):471-473.
[10] 胡霞，张咏梅，石玥，等.室旁核内血管紧张素Ⅱ对大鼠胃缺血/再灌注后胃黏膜 NF- κB表达的影响[J].徐州医学院学报，2007，27(12 ):771-774.