作者：杨效宁，孙天威，王启明 孙一公，曹雷
【摘要】 目的 探讨纤维环穿刺法诱导椎间盘退变模型的可行性和科学性。方法 新西兰大白兔18只， 经右侧腹膜外入路用弯血管钳夹持16G 穿刺针准确刺入L3-4、L4-5、L5-6 椎间盘的纤维环， 深度控制在5 mm。于术前及术后4、8、12 周对造模后的椎间盘及对照组的椎间盘(以L1-2、 L2-3、L6-7为对照) 行计算机X线摄影(computed radiography，CR)、MRI 检查， 并进行组织学观察。结果 从手术后第4～12周，造模后的椎间盘高度指数(disc height index，DHI)呈递减趋势，MRI T2WI 信号呈现持续减弱趋势(P<0.01);组织学观察发现4、8周造模组髓核细胞逐渐减少，12周组髓核细胞几乎被纤维软骨组织替代，纤维环排列不整齐，与髓核界限不清。结论 纤维环穿刺法可以诱导兔椎间盘的缓慢退变， 为临床深入研究椎间盘的退行性变提供了切实可行的动物模型。
【关键词】 椎间盘退变;纤维环穿刺;兔;影像学
Abstract: Objective To investigate the feasibility and scientificalness of establishing an animal model of intervertebral disc degeneration induced by needle puncture in the anulus fibrosus. Methods 18 New Zealand white rabbits under anesthesia underwent puncture of the L3-4， L4-5 and L5-6 lumbar intervertebral discs by 16-gauge needle at a depth of about 5 mm in the right anterolateral anulus fibrosus. Computed radiography (CR)， magnetic resonance imaging scans (MRI)， and histological observations of the discs in both the experimental groups and control groups (L1-2， L2-3， L6-7) were conducted preoperatively and at postoperative 4th， 8th， 12th weeks， respectively.Result From the postoperative 4th week to 12th week， disc height index (DHI) of CR and T2WI of MRI exhibited a progressive decrease of signal intensity (P<0.01). Histological analyses revealed progressive decrease of nucleus pulposus cells (P<0.01). In the postoperative 12th week group， nucleus pulposus cells were nearly replaced by fibrous cartilage tissue. Annular arrangement became irregular with ill-defined margin from the nucleus pulposus.Conclusion The anulus needle puncture can induce the progressive degeneration of the intervertebral disc in rabbits. This model is available for the clinical study of degenerative diseases of the intervertebral discs.
Key words: intervertebral disc degeneration; annulus needle puncture; rabbit; imaging
腰腿痛是影响人类健康的常见病与多发病，而椎间盘退变是腰腿痛的一个主要原因[1]。然而腰椎间盘退变的病因、发病机制和病理生理过程至今尚无定论，值得进一步探讨。目前，腰椎间盘退变疾病的治疗仅限于对症治疗及改善临床症状。因此，有必要建立一种能够模仿人椎间盘长期缓慢累积性损伤为特点的椎间盘退变动物模型，作为可靠、有效的试验载体，对腰椎间盘退变进行深入研究，同时也能够利用退变模型验证延缓、阻止及可逆转椎间盘退变的药物疗效，甚至作为基因治疗、组织工程学研究的试验载体，为临床深入研究人类腰椎间盘退变提供可靠的理论依据。
虽然目前建立腰椎间盘退变动物模型的方法很多，但都存在各种各样的不足和缺陷[2-3]。最近研究发现，髓核的退变率与纤维环受损伤程度密切相关。王靖等[4]和Masuda等[5]用18G针刺伤兔纤维环方法能够制成缓慢、累积性损伤，类似于人类椎间盘退变的动物模型，但是相关的影像学等实验资料仍然不够充分。本研究应用16G穿刺针纤维环刺伤法建立兔腰椎间盘退变的动物模型，通过对术前及术后4、8、12周的计算机X线摄影(computed radiography， CR)、MRI影像资料研究，反映各个时间段椎间盘退变程度;同时进行组织学观察，探讨建立椎间盘退变动物模型的可行性和科学性。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 普通级新西兰大白兔18只(由天津中医药大学实验动物中心提供)，雌雄各半，体重2.5～3.0 kg，1岁龄。纳入标准：无明显全身免疫性疾病，无急慢性传染病。经CR、MRI检查确认无脊柱及椎间盘病变。分组：以每只兔的L3-4、L4-5、L5-6椎间盘为造模组，以L1-2、L2-3、L6-7为对照组。
1.2 主要实验设备及试剂 动物解剖器械及16G穿刺针，便携式CT仪(美国柯达公司)，1.5T超导型磁共振扫描仪(西门子公司)，全自动脱水机、全自动石蜡包埋机(苏州仪器设备公司)， 病理组织漂烘仪(上海康生小型医疗设备有限公司)，切片机(德国Leitz公司)，显微镜(Olympus公司)。甲醛、乙醇等主要试剂为国产分析纯。
1.3 手术操作 术前实验动物标准饲养2周。18只新西兰大白兔麻醉后，经右侧腹膜外入路，分别准确暴露L3-4、L4-5、L5-6椎间盘，用弯嵌夹持16G穿刺针针头，尖端保留5 mm长度，于纤维环正中平行于终板向椎间盘中央刺入，深度控制在5 mm，刺入后维持5 s，拔出穿刺针，无髓核脱出，逐层缝合。手术后肌注庆大霉素8万U，持续5天，以预防感染。术后将动物随机分为4、8、12周3个模型组，每组6只，分笼常规饲养。
1.4 影像学检查方法
1.4.1 CR检查 分别于术后4、8、12周，将每组6只兔子进行CR检查，所有CR影像资料由放射科医生进行盲法评估，应用Unisight软件，测量腰椎指数(测量方法见图1)，随机抽取8个椎间盘高度指数(disc height index，DHI)进行统计学分析。C为前椎间盘高度(椎间隙前1/4处高度);D为后椎间隙高度(椎间隙后1/4 高度);A 为上位椎体前高度;B 为上位椎体后高度;E 为下位椎体前高度;F 为下位椎体后高度。DHI=100×2×(C+D)/(A+B+E+F)。
图1 DHI的测量
1.4.2 MRI检查 分别于术后4、8、12周对各组动物进行MRI检查。对兔腰椎行矢状位T2加权像(T2WI)扫描，系列重复时间/回波时间(TR/TE)为5 000/128 ms，层厚3 mm，层间距1 mm。所有MRI影像学资料由放射科医生进行盲法评估，以改良的Thompson分级法作为评估标准，共分4级：①1级为正常;②2级为信号轻度减弱，伴有高信号区范围的缩小;③3级为信号中度减弱;④4级为信号重度减弱。随机抽取6只兔子的MRI片，将其与术后4、8、12周组MRI片(每组各6张)进行比较分析，按改良的Thompson分级法对每张片L3-4、L4-5、L5-6的T2WI进行分级并进行统计学分析。
1.5 石蜡切片苏木精-伊红染色 甲醛固定的椎间盘组织经脱水、透明、包埋后切片，常规苏木精-伊红染色，封片后镜下观察。
1.6 统计学处理 应用SPSS 12.0统计软件进行分析。组间计量资料比较采用配对t检验。MRI分级资料采用双向有序行×列表χ2检验(Fisher确切概率法)。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 兔CR观察结果 所有实验用兔均成活，从术前及术后4、8、12周兔腰椎CR可见，造模组椎间隙逐渐变窄，椎体前缘唇样增生逐渐明显，而对照组椎体无明显变化，椎间隙高度基本无明显改变(图2)。2组DHI的比较见表1。表1 2组DHI比较(n=6，±s)与对照组比较：*P<0.05图2 术后不同时期椎间隙的CR检查
A. 术后4周;B.术后12周(箭头示损伤位置)2.2 MRI检查结果 从对照组及术后4、8、12周兔腰椎MRI 的T2WI上可见，对照组髓核信号强度无明显改变(图3)。改良的Thompson分级结果见表2，采用双向有序行×列表卡方检验，计算Fisher精确概率值为1.86×10-7(P<0.01)，说明髓核T2信号下降与造模后时间长短有显著的关系，即造模后时间愈长，造模组髓核信号强度降低愈明显。表2 兔腰椎间盘退变模型不同时间点MRI扫描结果
2.3 兔腰椎间盘组织的病理组织学改变 肉眼观可见对照组髓核呈白色胶冻状， 纤维环呈同心圆环状，排列整齐，包绕髓核;造模组术后随着时间延长，髓核颜色变灰暗，髓核量也随着时间的延长而减少，可见纤维环向中心迁移。苏木精-伊红染色光镜下观察：对照组在术前及术后各阶段组织学无明显改变，纤维环排列整齐清晰，中央髓核组织可见大量的脊索细胞和少量的类软骨细胞(图4A);4、8周造模组髓核细胞逐渐减少;12周组髓核几乎被纤维软骨组织替代，纤维环排列不整齐，与髓核界限不清(图4B)。
图4 正常与退变椎间盘(苏木精-伊红染色，×200)
3 讨 论
3.1 建立腰椎间盘退变动物模型的意义及方法的选择 关于椎间盘退变的病因、发病机制及早期防治的有效措施，一直是近年来研究的热点。但是人类腰椎间盘退变是一个复杂、漫长、多因素的病理过程，如果能寻找一种符合人类解剖生理功能、周期短、可重复性的实验动物作为临床研究的替代，可极大缩短实验所需的时间，并可作为椎间盘退变的病因病理，甚至是基因、组织工程学研究的一个很好平台。吴靖平等[6]采用截除大鼠双前肢和特殊饲养的方法，于18个月后光镜检查证实其椎间盘均发生了严重的髓核和纤维环退变，建立了应力型椎间盘退变模型。MacLean 等[7]研究表明压力可以导致应力在椎间盘中的重新分配，出现局部的生物学反应。从生物力学的角度肯定了这种模型的可行性。但该法仅局限应用于小体型动物。Sahlman等[8]应用基因敲除技术使小鼠表达胶原的基因失活，继而发生椎间盘退变，将基因工程技术纳入其中。但是操作过于复杂，对实验条件要求较高，限制了其广泛应用。
本实验采用16G穿刺针从纤维环前正中刺入，深度掌握在5 mm，不会造成髓核急性突出。CR可见腰椎椎体骨质逐渐唇样变，椎间隙高度总体上呈逐渐降低趋势，DHI测量有统计学意义;造模前及造模后椎间盘髓核MRI信号总体上呈逐渐降低的趋势，说明造模时间越长髓核退变越明显[9]。未造模的髓核信号强度无明显改变。病理组织学观察也证实了椎间盘退变后出现的一系列病理改变。随着造模时间的延长，髓核的脊索细胞及软骨样细胞呈减少趋势，纤维环排列紊乱、断裂。由此可见，纤维环穿刺法能够诱导腰椎间盘缓慢退变，很好地模拟了人类腰椎间盘退变的过程，具有相似的生化改变及病理过程。
3.2 椎间盘退变模型的机制探讨 目前认为这种刺伤诱导腰椎间盘退变的机制是通过造成纤维环损伤，引起急性椎间盘突出和髓核压力降低，髓核相对密闭的容积压力平衡被打破，启动椎间盘退变的级联反应。有研究认为退变与椎间盘的血供特点有关：纤维环外层有起自脊椎动脉的小血管供应，而内层纤维环、髓核通过软骨终板的渗透而获得营养，故损伤后愈合能力差;椎间盘退变及终板下骨质硬化正是从髓核含水量减少开始。还有研究认为髓核组织是与机体免疫系统相隔绝的，纤维环或软骨终板这一生理屏障受到破坏后，髓核组织就暴露于机体的免疫系统之中，进而激发一系列的自身免疫反应，导致髓核细胞凋亡，椎间盘退变[10]。
本实验证实了通过纤维环刺伤法可以诱导新西兰大白兔腰椎间盘的退变，符合人类腰椎间盘退变的病理过程，且模型制作较为简单，重复性好，可以作为研究椎间盘退变的动物模型，并能够提供大样本的实验数据。但是本模型也存在一些不足之处，如：通过人为因素诱导动物椎间盘退变，未考虑重力因素的作用;致退变时间较短暂，与人类椎间盘退变的缓慢过程存在一定差异;大白兔的脊柱在生物力学及解剖学上与人类存在一定的差异等。所有这些问题今后还需改进和优化。
参考文献
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