厄贝沙坦抑制高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化效应和人脐静脉血管内皮细胞损伤

　　　　 作者：鲁敏，卢群，任燕，田刚

【摘要】 目的 探讨厄贝沙坦对高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化效应及人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的影响。方法 取生长良好的HUVEC进行实验。将细胞分为4组：正常浓度葡萄糖对照组(葡萄糖终浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖终浓度为33.3mmol/L)、厄贝沙坦干预组和抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(Nacetylcysteine， NAC)干预组。干预组首先用厄贝沙坦(10-5mol/L)和NAC(10mmol/L)分别预作用1h，而后加入33.3mmol/L葡萄糖共同孵育24、48、72h。分别采用TBARS法和分光光度比色法检测培养上清液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与正常浓度葡萄糖组比较，高糖组MDA含量显著升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01);高糖作用24h 时MDA含量已达到较高水平(P<0.01)，且随葡萄糖作用时间的延长(48、72h)MDA含量呈上升趋势，但与高糖作用24h比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和NAC组MDA含量均显著下降(P<0.05)，SOD活性则均明显升高(P<0.05)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和NAC组各时点细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)，高糖对HUVEC细胞形态的损伤明显减轻。结论 厄贝沙坦部分通过抑制氧化应激作用降低高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化效应，保护HUVEC。

【关键词】 厄贝沙坦;葡萄糖;低密度脂蛋白;氧化应激;动脉粥样硬化

ABSTRACT: Objective To discuss the influences of irbesartan on high glucoseinduced lipid oxidation effect and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) injury. Methods HUVECs of the logarithmic phase were pided into four groups: normalconcentration glucose control group (glucose final concentration of 5.5mmol/L)， highglucose group (glucose final concentration of 33.3mmol/L)， irbesartan intervention group， and antioxidant Nacetylcysteinyl acid (NAC) intervention group. The intervention groups were first treated with irbesartan (10-5mmol/L) and NAC (10mmol/L) for 1h， respectively， then coincubated with high glucose (glucose final concentration of 33.3mmol/L) for 24h， 48h and 72h. Malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity of culture supernatant were determined by TBARS method and spectrophotometric assay， respectively. Results MDA content increased significantly (P<0.01) and SOD activity decreased significantly (P<0.01) in high glucose group compared with control group. MDA content reached a considerable level (P<0.05) when HUVECs were treated with high glucose for 24 hours; with time prolonging for 48 hours and 72 hours， the level of MDA had a slightly upward trend， but with no statistical significance (P>0.05). Compared with that in high glucose group， MDA content significantly decreased (P<0.05) and SOD activity significantly increased (P<0.05) in irbesartan and NACtreated groups. Apoptosis of HUVECs was significantly reduced (both P<0.05) at each time point in irbesartan and NACtreated groups， and the damage of high glucose on morphology of HUVECs also reduced significantly. Conclusion Irbesartan reduces lipid oxidation induced by high glucose partially by inhibiting oxidative stress and thus protects HUVEC.

　　KEY WORDS: irbesartan; glucose; lowdensity lipoprotein; oxidative stress; atherosclerosis

　　目前认为，高糖环境是所有类型的糖尿病微血管病变及大血管病变的中心始动因素。高浓度葡萄糖具有促脂质氧化效应，并可与低密度脂蛋白 (LDL)协同诱导内皮细胞凋亡[1]。高胆固醇不但可以引起血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)水平明显升高，而且可以增加血管平滑肌细胞对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激的反应性，提示AT1阻断剂(ARB)可能具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis， As)作用[2]。ARB药物能否通过降低高糖的促脂质氧化效应而减轻高糖所致的内皮细胞损伤，对内皮细胞产生保护作用，目前国内外鲜有报道。本研究以培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)为研究对象，旨在观察厄贝沙坦对高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化效应及HUVEC损伤的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人脐静脉内皮细胞株(Cambrex Bio Science Walkersville公司);D葡萄糖(上海华舜生物工程有限公司);厄贝沙坦(Sanofi Aventis公司);N乙酰半胱氨酸(NAC)(Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)(北京北方伟业发展有限公司);丙二醛(MDA)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所);ANNEXINⅤFITC凋亡检测试剂盒(上海美季生物技术有限公司)。倒置显微镜(日本OLYMPUS CK40)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 厄贝沙坦的配制 将厄贝沙坦用二甲基亚砜(DMSO)溶解，经细胞培养液稀释配制成浓度1mmol/L的溶液，后根据所需浓度稀释不同倍数。DMSO终浓度小于0.5mL/L。

　　1.2.2 细胞培养 HUVEC 用含200mL/L胎牛血清的DMEM培养基在37℃、50mL/L CO2条件下进行培养，瓶底被细胞铺满80%时，用2.5g/L胰酶消化、传代。将生长良好的内皮细胞以2.5×105/mL接种于6孔培养板，2mL/孔。台盼蓝细胞存活染色方法检测示细胞存活>95%，待次日细胞贴壁后，改用无血清的DMEM培养基培养8h后开始实验分组。

　　1.2.3 实验分组 将HUVEC分为4组，每组设6个平行孔(n=6)：①正常浓度葡萄糖对照组(葡萄糖终浓度5.5mmol/L);②高糖组(葡萄糖终浓度33.3mmol/L);③厄贝沙坦干预组;④NAC干预组。干预组用厄贝沙坦(10-5mol/L)[3]和NAC(10mmol/L)分别预作用1h，而后加入33.3mmol/L葡萄糖共同孵育24、48、72h。

　　1.2.4 人天然低密度脂蛋白的提取 取健康人血浆，按张林华等[3]一次性密度梯度超速离心法提取。以牛血清白蛋白(1g/L)为标准品，用Lowry法测定蛋白浓度。

　　1.2.5 细胞上清液中MDA含量和SOD活性的测定 按试剂盒说明书的要求先求出样本的最佳加样量。HUVEC经上述同样处理后，取细胞上清液，按试剂盒说明书的要求测定各样本的吸光度，并依下列公式计算出MDA含量和SOD活性。MDA含量(μmol/L)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10μmol/L)×样本测试前稀释倍数;SOD活性(u/mL)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度÷50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。

　　1.2.6 细胞凋亡率的测定 按ANNEXIN VFITC凋亡检测试剂盒说明测定。具体步骤如下：将收集的细胞用冷PBS洗涤2次，然后用结合缓冲液重新悬浮细胞，浓度为1×106细胞/mL;移液器吸取100μL溶液置5mL培养管;加入5μL的ANNEXIN VFITC和5μL的碘化丙啶(propidium iodide， PI);轻轻地摇匀细胞，室温下避光孵育15min;每管加入400μL结合缓冲液，1h内用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

　　1.3 统计学处理 所得数据均用SPSS 11.5软件进行统计处理。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，所有数据经正态分布及方差齐性检验后，多组间均数比较用方差分析，两组间均数比较采用方差分析两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学观察 荧光显微镜下观察，正常HUVEC为扁平单层小三角形、短梭形，细胞边界清楚，透明度高，胞质丰富，密集处呈铺路石状镶嵌排列，稀疏处为短梭形，紧密贴壁，细胞核呈圆形或椭圆形， 偶见双核(图1A)。高浓度葡萄糖作用72h后细胞形态改变，细胞变为椭圆形或圆形，贴壁细胞有部分皱缩，细胞密度明显下降，颗粒增多，大小不匀，间隙增大，甚至细胞脱落溶解(图1B)。10-5mol/L厄贝沙坦(图1C)和10mmol/L NAC(图1D)分别干预72h，细胞损伤明显减轻，颗粒减少，连接紧密，边界清楚，细胞形态基本接近正常。

　　2.2 脂质过氧化修饰 与正常浓度葡萄糖组比较，高糖组MDA含量显著升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01)，说明高浓度葡萄糖具有一定的促脂质氧化作用。高糖作用24h时，与正常浓度葡萄糖组比较，MDA含量已达到较高水平(P<0.01)，且随葡萄糖作用时间的延长(48、72h)MDA含量呈轻度上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和NAC组MDA含量均显著下降(均P<0.05)，SOD活性则均明显升高(P<0.05，表1)。提示厄贝沙坦抑制高浓度葡萄糖诱导的脂质氧化。表1 高糖作用24h各组HUVEC培养细胞上清液中MAD含量及SOD活性与高糖组比较，*P<0.05;与对照组比较，**P<0.01。

　　2.3 细胞凋亡率 与正常浓度葡萄糖相比较，33.3mmol/L高浓度葡萄糖作用24h时细胞凋亡率显著增加(P<0.01)，且随着葡萄糖作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01)。与高糖组比较，厄贝沙坦组和NAC组各时点细胞凋亡率均显著降低(P<0.05，表2)。

　　3 讨 论

　　高浓度葡萄糖在生物体系中产生氧化应激，生成大量氧自由基，促进细胞膜脂质氧化及LDL氧化[4]。表2 厄贝沙坦和NAC抑制高浓度葡萄糖诱导的HUVEC细胞凋亡与高糖组比较，*P<0.05;与对照组比较，**P<0.01;与高糖组24h比较，☆P<0.05;与高糖组48h比较，△P<0.05。

　　BROWNLEE[5]认为高血糖引发的过氧化产物对血管内皮细胞损伤是糖尿病血管并发症的根本原因之一。因此，防治高浓度葡萄糖诱导的氧化应激和血管内皮功能障碍具有重要意义。正常情况下体内产生少量自由基属生理范围，可被抗氧化防御系统清除，使自由基的产生及清除处于动态平衡状态。当高浓度葡萄糖作用于血管内皮细胞时，此平衡状态被打破，自由基积蓄从而造成内皮细胞损伤[6]。

　　血管内皮细胞是高糖损害的一个重要的靶器官。高糖通过多种途径导致血管内皮细胞功能障碍，但其损伤的机理并不十分清楚。本研究小组既往研究观察到，高糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮微粒释放并促进细胞凋亡[7]。华军益[8]等研究发现，40mmol/L高浓度葡萄糖作用72h可诱导内皮细胞V304损伤和凋亡。20mmol/L葡萄糖在3d内均未诱发内皮细胞V304凋亡，加入低密度脂蛋白后凋亡出现时间提前，凋亡率亦显著增加，表现出显著协同作用，并且在一定浓度范围内随葡萄糖浓度增加，协同致凋亡作用增强，可能与高浓度葡萄糖促进膜脂质过氧化和细胞介导的低密度脂蛋白氧化作用直接相关。此外，目前认为，高血糖使内皮细胞活性氧(ROS)自由基增多，包括超氧阴离子、羟自由基和h3O2，同时重要抗氧化蛋白(如Cu/ZnSOD)由于糖基化而失活使其抗氧化防御屏障减弱，打破了机体氧化抗氧化能力的平衡，导致血液中活性氧含量增加，促成氧化应激状态，对血管内皮细胞产生毒性作用，从而造成VEC的氧化损伤[910]。本研究结果显示，高糖组MDA含量最高，并呈时间依赖性，24h即达较高水平，而SOD活性最低，与文献报道一致。高糖组HUVEC细胞密度明显下降，细胞形态改变，细胞凋亡率较正常对照组、厄贝沙坦组和抗氧化剂NAC组均显著升高，而内皮细胞凋亡率随高浓度葡萄糖作用时间的延长而逐渐增加，提示血管内皮细胞的损伤与糖尿病的病程有关。进一步证实高浓度葡萄糖刺激促进血管内皮细胞凋亡，导致血管内皮细胞功能障碍。厄贝沙坦和NAC能够阻断高糖所引起的HUVEC细胞凋亡，减轻高糖对HUVEC的损伤。

　　目前，已经有大量药理学研究从减少危险因素，抑制血管内皮细胞损伤等多方面干预糖尿病血管并发症的发生和发展，其治疗的靶点包括脂质修饰、一氧化氮(NO)利用率、氧化应激、血管炎症、血管平滑肌细胞(VSMC)增殖等[1112]。血管紧张素Ⅱ可使氧自由基产生增加。而血管紧张素转换酶抑制剂使血管紧张素Ⅱ生成减少，使氧自由基产生减少，减少氧化应激引起的NO分解[13]。某些血管紧张素转换酶抑制剂，如卡托普利，其分子结构中的巯基与清除氧自由基密切相关。研究表明，脂质过氧化不仅可以引起AT1水平明显升高，而且可以增加SMC对Ang II刺激的反应性，这就提示ARB药物可减少氧化应激，改善内皮细胞功能，降低SMC增殖，激活凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX1)等[14]。研究观察到氯沙坦50～100mg/d治疗1个月后，原发性高血压患者NO的合成和释放增加[15]。有关厄贝沙坦可否降低高糖的促脂质氧化效应从而减轻高糖所致的内皮细胞损伤尚不十分明了。本研究观察到，厄贝沙坦和NAC预处理能显著降低高浓度葡萄糖诱导的MDA含量，提高人血管内皮细胞SOD活性，说明厄贝沙坦和NAC均可有效抑制33.3mmol/L高浓度葡萄糖的促脂质氧化效应，提高内皮细胞抗氧化能力，减轻高糖对内皮细胞造成的脂质过氧化损伤，对糖尿病状态下血管内皮细胞具有保护作用，并在药物作用24h即可抑制高浓度葡萄糖促脂质氧化。

　　本研究结果提示，在体外实验中厄贝沙坦可能是通过抑制AngⅡ与AT1结合，抑制高糖诱导的氧化应激，从而减少脂质氧化效应，保护HUVEC。但是，厄贝沙坦对高糖所致内皮损伤保护作用的分子机制尚不清楚，有待于进一步研究。

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