Myocardin在大鼠血管平滑肌细胞表型转化中的作用机制

【摘要】 目的 探讨Myocardin在血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用机制。方法 采用细胞转染的方法使外源性Myocardin和SRF在培养的VSMC中过表达，应用RTPCR、Western印迹及改良考马斯亮蓝染色法等方法检测转染后VSMC收缩型特异性标志基因的表达及细胞骨架的结构变化。结果 当含有SRF和Myocardin编码基因的表达质粒共同转染培养的VSMC时，收缩型VSMC的标志基因SM22α和SMαactin的mRNA和蛋白表达显著上调，而且促进VSMC细胞骨架的重构。而培养的VSMC单独转染SRF或Myocardin的表达质粒后，相关指标并无明显改变。结论 外源性Myocardin和SRF的强制表达可以促进VSMC特异性标志基因的表达以及细胞骨架的重构，从而诱导处于增殖状态的VSMC进入静止期，并向收缩型转变。

【关键词】 Myocardin; 血清应答因子;血管平滑肌细胞 ;表型转化

　血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化参与了多种心血管疾病的发生发展过程，研究表明血清应答因子(SRF)与其顺式元件CArG〔CC(A/T)6GG〕box的相互作用是启动VSMC特异性基因表达的核心机制〔1〕。但是，CArG元件并非VSMC特异性基因所特有，它广泛存在于平滑肌、心肌、骨骼肌以及一些非肌细胞中。因此，单用CArG与SRF相互作用很难解释基因表达的细胞特异性。Myocardin是2001年发现的核蛋白SAP结构域家族的一个成员〔2〕，可在多种非肌细胞中，以SRF依赖的方式启动平滑肌特异性基因的表达〔3〕，但在VSMC 表型转化过程中Myocardin的表达变化尚未见报道。本研究旨在探讨外源性Myocardin和SRF在VSMC中过表达时VSMC特异性标志基因的表达及细胞骨架的结构变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 兔抗人SM22α多克隆抗体(本室制备)，小鼠抗大鼠SMαactin单克隆抗体(Sigma公司)，HRP1标记的羊抗兔、羊抗小鼠二抗(北京中山公司)，RTPCR试剂盒(Applied Biosystems)，其他试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.2 细胞培养与转染 取5周龄SD大鼠胸腹主动脉，用贴块法分离VSMC，加入含10%胎牛血清(FBS)的M199进行培养，用0.25% 胰蛋白酶消化传代，取3～7代细胞进行实验。当细胞生长至70% 密度时，用脂质体介导法分别转染或共转染pCGNSRF和pCDNAMyocardin表达质粒，所用质粒浓度为5 μg/ml，操作按ESCORTTM Ⅳ 转染试剂盒说明进行。分别在转染后48 h收集不同条件处理的VSMC，提取总RNA和细胞总蛋白。

　　1.3 RTPCR 用异硫氰酸胍一步法提取总RNA。以总RNA为模板，进行RTPCR，检测不同条件处理的VSMC中SM22α和SMαactin基因的表达。SM22α上、下游引物序列为5′TTCTGCCTCAACATGGCCAAC3′和5′CACCTTCACTGGCTTGGATC3′。SMαactin引物序列为5′CCTGAAGTATCCGATAGAAC3′和5′GCCGACTCCATTCCAATGAA3′。反应以GAPDH作内参照，对模板用量进行标化。PCR产物经8% PAGE分离、鉴定。

　　1.4 Western 印迹分析 按文献〔4〕方法裂解VSMC，提取细胞总蛋白，用改良酚试剂法测定蛋白含量。各组均取含80 μg蛋白的裂解液经8%SDSPAGE分离，通过电转移将蛋白印迹至PVDF膜上，用5% 脱脂奶粉封闭膜上非特异性结合位点，继之与抗SRF抗体室温反应5 h，洗膜三次。随后加入HRP1标记的二抗室温反应2 h， 4氯1萘酚/h3O2溶液显色。法国Vilber Lourmat公司的Bio ID数码成像分析软件对Western 印迹结果进行定量分析。

　　1.5 细胞骨架的观察 按文献〔5〕方法加以改良。将在盖玻片上培养的转染48 h后的VSMC用冷PBS清洗两次，2% 多聚甲醛预固定10 s，1% Triton X100处理20 min，以除去胞浆内的可溶性蛋白。PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.2%考马斯亮蓝R250染色，蒸馏水漂洗，加拿大树胶封片。于显微镜下观察细胞骨架的变化。

　　1.6 统计学分析 所有数据均用x±s表示，采用SAS V8软件进行统计学处理分析，组间比较用单因素方差分析检验。

　　2 结 果

　　2.1 Myocardin和SRF激活VSMC特异性基因的表达 由于SM22α和SMαactin是收缩型VSMC的最具特点的标志基因〔6〕，所以本研究中以二者的表达活性作为判定VSMC表型的依据。在正常培养的VSMC中，即使细胞生长至完全汇合而出现接触抑制时也难以检测到SM22α和SMαactin的mRNA，说明此时的VSMC处于去分化状态。当培养的VSMC单独转染SRF或Myocardin的表达质粒后，SM22α和SMαactin的mRNA水平并未发生明显改变。当SRF和Myocardin的表达质粒共同转染培养的VSMC时，SM22α和SMαactin的mRNA水平显著增加，见图1和表1。这表明外源性Myocardin和SRF的强制表达可诱导处于增殖状态的VSMC进入静止期，并向收缩型转变。SRF和Myocardin的表达质粒共同转染VSMC引起的SM22α和SMαactin蛋白的表达变化进一步被Western结果所证实，见图2，表2。

　　2.2 外源性SRF和Myocardin的强制表达对细胞骨架的影响 由于SM22α和SMαactin是参与调节VSMC细胞骨架结构表1 VSMC中SM22α和SMαactin mRNA光密度扫描分析结果　表2 VSMC中SM22α和SMαactin蛋白表达变化的光密度扫描分析结果1.正常培养的VSMC;2.转染pCGNSRF表达质粒;3.转染pCDNAMyocardin表达质粒;4.共转染pCGNSRF和pCDNAMyocardin表达质粒图1 外源性SRF和Myocardin强制表达后VSMC中SM22α和SMαactin的mRNA水平1.正常培养的VSMC;2.转染pCGNSRF表达质粒;3.转染pCDNAMyocardin表达质粒;4.共转染pCGNSRF和pCDNAMyocardin表达质粒图2 外源性SRF和Myocardin强制表达后VSMC中SM22α和SMαactin蛋白的表达和细胞收缩的调节蛋白〔7〕。为了观察当SRF和Myocardin的表达质粒共同转染VSMC时，SM22α和SMαactin的表达水平显著增加是否影响了细胞骨架的形成。本实验采用我室建立的改良考马斯亮蓝染色法显示VSMC内的骨架结构，见图3。正常培养的生长至汇合状态的VSMC中，细胞骨架呈稀疏的网格状，淡染，结构模糊(图3A)。将SRF和Myocardin的表达质粒共转染至VSMC并表达后，细胞骨架的纹理变得较为清晰，网格致密，而且沿VSMC极性呈束状分布(图3D)。在相同条件下，单独转染SRF或Myocardin表达质粒的VSMC不出现上述变化(图3BC)。这说明SRF和Myocardin的强制图3 外源性SRF和Myocardin强制表达对细胞骨架的影响(×400)表达可以促进VSMC细胞骨架的重构，推测由此促进了VSMC从合成型向收缩型的转变。

　　3 讨 论

　　VSMC表型具有可变性的特点。正常成熟血管壁中的VSMC呈收缩型，即处于分化状态，属分化型VSMC。分化型VSMC呈现典型的纺锤形特征，通过表达一系列特异性收缩蛋白，例如平滑肌α肌动蛋白(SMαactin)和SM22α等来维持其特定的功能。这些基因的表达是分化型VSMC的重要标志。当血管内皮受损(如动脉粥样硬化、血管内皮损伤等)或将VSMC进行体外培养时， VSMC迅速发生表型转化，表现为分化型标志基因表达下调，去分化型标志基因重新开放，收缩功能消失，合成分泌大量的细胞外基质并获得迁移和增殖能力，这种状态的VSMC称为合成型或去分化型VSMC。由VSMC表型转化所引发的血管重构是血管再狭窄和动脉粥样硬化等血管病变发生发展的根本原因。因此，研究VSMC表型调节的分子机制，对上述相关疾病的防治具有重要意义。

　　目前对VSMC表型转化分子机制的了解远不如骨骼肌和心肌清楚，但研究发现几乎所有的平滑肌特异性基因在其调控区都包含两个或更多的CArG{CC(A/T)6GG}元件，即血清应答因子的结合位点，SRE与CArG元件的相互作用是启动VSMC特异性基因表达的核心机制〔1〕。但是，CArG元件并非VSMC特异性基因所特有，它广泛存在于平滑肌、心肌、骨骼肌以及一些非肌细胞中。因此，单用CArG与SRF相互作用很难解释基因表达的细胞特异性。

　　关于SRF在血管平滑肌细胞表型转化中的作用机制，目前国外研究主要集中在两个方面：一种观点认为，通过拼接不同外显子，SRF在体内以各种亚型表达，不同的亚型可以增强或抑制平滑肌特异性启动子的活性，几种亚型之间的相互平衡保证了正常血管平滑肌细胞分化的进程;另一种观点认为SRF在VSMC特异性基因表达调控中起一个平台作用，可以募集其他的转录因子，SRF通过与一个或数个平滑肌特异性转录因子相互作用形成蛋白复合体，即可启动肌特异性基因的表达。

　　Myocardin是核蛋白SAP结构域家族的一个成员，SAP结构域是一个保守的由33个氨基酸残基形成的模序，存在于许多核蛋白中，包含两个被一个甘氨酸残基分开的两亲性螺旋，类似于同源结构域蛋白的螺旋1和2。基本的和富含谷氨酰胺(Qrich)的结构域对于Myocardin结合SRF来说是非常重要的，一个亮氨酸拉链样的结构域可以介导这个家族的成员形成同源或异源二聚体。Myocardin蛋白在其羧基末端包含一个强有力的转录激活结构域，在其氨基末端有一个高度保守的MKL同源结构域。这个区域大约由120个氨基酸残基组成，包含两个或三个RPEL模序。RPEL是根据其保守序列中的4个氨基酸残基来命名的。RPEL重复序列的功能还不清楚。他们对于SRF靶基因的转录活化不是必需的〔8〕。Myocardin最早是由Olson在2001年发现的心肌细胞系的一个标志基因，在心肌的发育中持续表达〔9〕。随后的研究表明Myocardin基因在内脏及血管平滑肌中的表达水平等同于甚至超过其在心肌中的表达，而且Myocardin在内脏及血管平滑肌细胞中的表达更早于编码平滑肌标志基因的表达或与其一致。这些研究表明在组织特异性的平滑肌中Myocardin可能是SRF的重要辅助因子〔10〕。而且近来研究发现Myocardin可在各种非肌细胞中以一种SRF依赖性的方式启动平滑肌特异性基因的转录与表达〔11〕。Myocardin在未分化的胚胎干细胞中的强制表达可激活内源性SM22α、SM αactin以及calponinh1基因的转录和表达〔12〕。但Myocardin在VSMC表型转化中是否起作用尚未见报道。基于上述原因，我们观察了外源性SRF和/或Myocardin的强制表达对VSMC特异性基因的表达的影响，结果表明当培养的VSMC被单独转染SRF或Myocardin的表达质粒后，收缩型VSMC的标志基因SM22α和SMαactin的mRNA和蛋白水平均未发生明显改变。当SRF和Myocardin的表达质粒共同转染培养的VSMC时，SM22α和SMαactin的表达显著增加。这表明外源性Myocardin和SRF的强制表达可诱导处于增殖状态的VSMC进入静止期，并向收缩型转变。由于SM22α和SMαactin是参与调节VSMC细胞骨架结构和细胞收缩的调节蛋白，我们又从细胞骨架actin动力学的角度观察了SRF和Myocardin在VSMC表型转化中的分子作用机制。结果显示，SRF和Myocardin的强制表达可以促进VSMC细胞骨架的重构，推测由此促进了VSMC从合成型向收缩型的转变。

参考文献

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