达肝素钠对A549细胞生长状态及细胞周期的影响

　　　　　　 作者：陈克芳 陈芳兰 黄龙杰

【摘要】 目的 研究达肝素钠对体外生长的肺腺癌A549细胞活性及细胞周期的影响。方法 用6种不同浓度(0、2、10、50、100和500 IU/ml)的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT方法在4个时间点(6、12、24和36 h)检测细胞活性;将经过24 h普通培养的A549细胞继续在含有50 IU/ml达肝素钠的培养液中培育，以正常培育的细胞作为对照组，将两组细胞24 h后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期。结果 达肝素钠降低A549细胞活性，这种作用表现出时间依赖性和浓度依赖性;达肝素钠主要抑制细胞在G1期。结论 达肝素钠对A549细胞活性的降低与对细胞周期的抑制作用有关。

【关键词】 低分子量肝素;达肝素钠;肺腺癌;细胞周期

　肝素及其衍生物的抗细胞增殖作用，目前在平滑肌上进行的研究较多。Guyton等〔1〕报道，不论在体内还是在体外，肝素都能降低平滑肌细胞(SMC)的有丝分裂。其他部位的SMC，如气道及肠道、子宫肌层及子宫肌瘤的生长也能被肝素抑制〔2〕。也有在内皮细胞上进行的关于肝素的抗增殖作用研究，如Khorana等〔3〕报道肝素抗微血管内皮细胞(MVECs)和奇静脉内皮细胞的作用。关于未分级肝素(UFH)或低分子肝素(LMWH)对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用，目前较少有文献报道。该研究选用LMWH之一的达肝素钠进行相关研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器 A549细胞(兰州大学医学院实验中心冻存)。CO2细胞培养箱(Biorad公司);超净工作台(Clean Blench公司);全自动酶标仪(Biorad公司)。RPMI 1640培养基(Gibco);达肝素钠(Fragmin)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 MTT法检测细胞活性 将培养的A549细胞用胰酶消化，调整细胞浓度，培养24 h。弃去培养基，加入含有所需浓度达肝素钠的RPMI 1640培养基，继续培养。实验结束前4 h，加入MTT，继续培养。4 h后弃去培养基，加入DMSO，避光振荡10 min。选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值(OD)。

　　1.2.2 PI染色法检测细胞周期分布 将培养的A549细胞用0.25%的胰酶消化，传代到6孔板的各孔中，培养24 h。弃去培养基，加入含有所需浓度达肝素钠的RPMI 1640培养基，继续培养。在设定的时间点按组收集细胞。收集的细胞以预冷PBS洗涤2次。离心5 min，弃上清。 加入含0.5% PI和0.01%RNase染液，重悬细胞，室温避光反应30 min。1 h内流式细胞仪检测，在488 nm激发波长下测定DNA含量，分析细胞周期的分布情况。

　　1.3 统计学分析 数据以x±s表示，SPSS11.0统计软件分析，两组间比较用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 达肝素钠对A549细胞细胞活性的影响 用6种不同浓度(0、2、10、50、100和500 IU/ml)的达肝素钠干预A549细胞的生长，用MTT方法在4个时间点(6、12、24和36 h)检测细胞活性。达肝素钠能降低A549细胞活性，而且这种作用表现出时间和浓度依赖性。在不含达肝素钠的培养基中培育的细胞，其12 h和24 h的细胞活性基本一致，但24 h的细胞活性明显下降，这种下降是由培养基营养成分的耗竭所致，故24 h以前的细胞活性值较能准确反应药物对细胞的影响。该数据还显示，用高浓度的达肝素钠(100和500 IU/ml)培养细胞24 h后，A549细胞活性大部分被抑制，但这种抑制可能与药物的毒性作用有关。 50 IU/ml达肝素钠在干预细胞生长24 h后能抑制大约50%的细胞活性。为避免培养基成分的变化和药物毒性作用对实验结果的干扰，在随后的试验中，选择50 IU/ml达肝素钠为干预浓度，测定干预24 h后的各项指标。见图1。图1 达肝素钠对肺腺癌A549细胞细胞活性的影响

　　2.2 达肝素钠对A549细胞细胞周期的影响 为观察达肝素钠对A549细胞周期进展的影响，将经过24 h普通培养的A549细胞继续在含有50 IU/ml达肝素钠的培养液中培育，以正常培育的细胞作为对照组，将两组细胞24 h后以PI染液染色，用流式细胞仪检测并分析细胞周期的分布。流式细胞分析显示达肝素钠抑制细胞周期的进展。与对照组相比，实验组细胞在G1期比率显著增加〔(75.7±2.1)%、(54.8±1.9)%;P&<0.05〕，在S期比率明显降低〔(11.3 ±1.96)%、(32.1±1.5)%;P&<0.05〕。处于G2/M期的细胞比率虽有增加，但这种差异与对照组比较没有统计学意义〔(9.2±1.1)%、(11.3±2.1)%;P&>0.05〕。

　　3 讨 论

　　临床观察发现，以UFH和LMWH为主的抗凝治疗能改善小细胞肺癌(SCLC)的预后〔4〕。在385例进展期的实体瘤患者上进行的FAMOUS(the fragmin advanced malignancy outcome study)表明，皮下注射LMWH 1年后患者生存率增加5%;患者中位生存率由对照组24.3个月增加到试验组的43.5个月〔5〕。Klerk等进行的MALT(malignancy and lowmolecularweight heparin therapy)是在具有恶性肿瘤但没有静脉血栓栓塞的302例患者上进行的另外一项试验，其基本结果与FAMOUS类似〔6〕。研究还发现，LMWH能增强化疗药物的作用〔7〕。另外，LMWH在肿瘤治疗上表现出的良好作用不只与其抗凝作用有关〔8〕。

　　对于不同种类的细胞、不同状态的细胞，对不同种类的肝素可能表现不同的反应。文献表明，脱离静止状态的血管SMC对肝素的敏感性是处于指数增长的细胞的50到100倍〔9〕;但Mason等研究发现指数增殖状态的人奇静脉SMC对肝素的反应比静止的更明显〔10〕。

　　我们的研究发现，达肝素钠能够抑制A549细胞活性，而且这种作用表现出时间和浓度依赖性。50 IU/ml达肝素钠在干预细胞生长24 h后能抑制大约50%的细胞活性。用高浓度的达肝素钠(100 IU/ml和500 IU/ml)培养细胞24 h后，A549细胞活性大部分被抑制，但这种抑制可能与药物的毒性作用有关。达肝素钠对A549肺腺癌细胞体外生长及细胞周期的分布有影响。用50 IU/ml的达肝素钠干预细胞后24 h后，积聚在G1期的细胞明显增多;S期细胞比例也增加。上述细胞周期分布的改变提示，与G1期和S期有关的细胞调节因子参与了达肝素钠对A549细胞体外生长的影响。

　　肝素引起的细胞在G1期的积聚现象与多种机制有关。首先，细胞在G1期的积聚与肝素导致的p27KIP1蛋白表达的变化有关。p27KIP1蛋白的改变能抑制CDK2的活性，阻止细胞从G1进入到S期和延长G1期，最终导致细胞有丝分裂活性降低。其次，肝素能调节酪蛋白激酶Ⅱ、肝素结合细胞因子、组蛋白、拓扑异构酶Ⅱ和p53等〔11〕等蛋白的活性。另外， 肝素能够干扰蛋白激酶C(PKC)通路〔12〕，对PKC/MAPK/Jun/Fos/AP1信号转导产生直接的影响〔13〕。这些转录因子和早期反应基因的改变，都可能对细胞的增殖状态和细胞周期的进展产生影响。

参考文献

　1 Guyton JR，Rosenberg RD，Clowes AW，et al. Inhibition of rat arterial smooth muscle cell proliferation by heparin.In vivo studies with anticoagulant and nonanticoagulant heparin〔J〕.Circ Res，1980;46(5):62534.

　　2 Horiuchi A，Nikaido T，YaLi Z，et al.Heparin inhibits proliferation of myometrial and leiomyomal smooth muscle cells through the induction of alphasmooth muscle actin，calponin h1 and p27〔J〕.Mol Hum Reprod，1999;5(2):13945.

　　3 Khorana AA，Sahni A，Altland OD.Heparin inhibition of endothelial cell proliferation and organization is dependent on molecular weight〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003;23(11):21105.

　　4 Zacharski LR.Anticoagulants in cancer treatment：malignancy as a solid phase coagulopathy〔J〕.Cancer Lett，2002;186(1):19.

　　5 Kakkar AK，Levine MN，Kadziola Z，et al.Low molecular weight heparin，therapy with dalteparin，and survival in advanced cancer：the fragmin advanced malignancy outcome study (FAMOUS)〔J〕.J Clin Oncol，2004;22(10)：19448.

　　6 Klerk CP，Smorenburg SM，Otten HM，et al.The effect of low molecular weight heparin on survival in patients with advanced malignancy〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(10)：21305.

　　7 Icli F，Akbulut H，Utkan G，et al.Low molecular weight heparin (LMWH) increases the efficacy of cisplatinum plus gemcitabine combination in advanced pancreatic cancer〔J〕.J Surg Oncol，2007;95(6)：50712.

　　8 Smorenburg SM，van Noorden JCF.The complex effects of heparins on cancer progression and metastasis in experimental studies〔J〕.Pharmacol Rev，2001;53(1):93105.

　　9 Castellot Jr JJ，Addonizio ML，Rosenberg R，et al.Cultured endothelial cells produce a heparin like inhibitor of smooth muscle cell growth〔J〕.J Cell Biol，1981;90(2):3729.

　　10 Mason HR，Nowak RA，Morton CC，et al.Heparin inhibits the motility and proliferation of human myometrial and leiomyoma smooth muscle cells〔J〕. Am J Pathol，2003;162(6):1895904.

　　11 Ishii K，Katase A，Andoh T，et al.Inhibition of topoisomerase I by heparin〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1982;104(2):5417.

　　12 Herbert JM，Clowes M，Lea HJ，et al.Protein kinase C alpha expression is required for heparin inhibition of rat smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem，1996;271(42):2592835.

　　13 Au YPT，Dobrowolska G，Morris DR，et al.Heparin decreases activator protein1 binding to DNA in part by posttranslational modification of jun〔J〕.Br Circ Res，1994;75(1):1522.