作者：王欣欣 王丽珍 张伟 居红格
【摘要】 目的：观察早期糖尿病大鼠肾脏的结构和功能的变化。方法：建立链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型。分别在第1、2、4周3个时间点处死动物，取肾组织应用光镜技术观察肾组织的形态学改变；收集24小时尿液，测定尿肌酐及24小时尿微量白蛋白排泄量，眶静脉取血测定血肌酐，计算内生肌酐清除率。结果：各时间点对照组大鼠的血糖均在正常范围之内，且彼此间差异无统计学意义（P&>0.05），糖尿病模型组大鼠的血糖均显著高于正常对照组（P＜0.01）；在4周病程时，糖尿病模型组大鼠的肾小球囊腔增大，毛细血管袢减少，基质增多。结论：在糖尿病的早期阶段，肾脏的结构和功能已经开始发生改变。
【关键词】 糖尿病；糖尿病大鼠；肾脏
Abstract Objective:To observe the morphological and functional changes in the renal tissues of diabetic rats in the early period. Methods: Making diabetic models by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ).Light microscope was used to observe the morphological changes；Determining urinary albumin excretion and Ccr through 24 hours. Results: The blood glucose of rats in each normal control group was within normal range and there was no significant difference between groups(P&>0.05). While blood glucose was higher in diabetic model group than that in the normal control group at three time points， with the significant difference（P＜0.01). At the fourth week point， Bowman' capsule in the diabetic model group was enlarged， the capillary tuft was decreased and the mesangial matrix was increased. Conclusion: The morphology and function of the kidney in the rats with diabetis begin to change in early period.
Key words Diabetis; Diabetic mouse；Kidney
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的慢性并发症之一，在糖尿病患者群中的发生率约为20%～40%，伴有终末期DN者5年生存率小于20%。DN已成为西方国家人群终末期肾衰的主要病因，也是糖尿病致命的主要原因。在糖尿病的早期阶段肾脏的结构和功能都发生了一定程度的改变，Murussi等[1]的研究提示尿微量白蛋白（UAE）和肾小球滤过率（GRE）的测定有助于对DN的早期诊断。正确认识这些改变对于糖尿病的预防和早期治疗都有重要的作用。本实验通过制备糖尿病大鼠动物模型，在糖尿病早期对大鼠肾脏的结构和功能进行观察。
1 对象与方法
1.1 实验动物与实验仪器 普通级健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠60只，由辽宁医学院实验动物中心提供，体重180～220g，饲养温度20～25℃，食用标准动物饲料。
主要仪器设备包括One Touch血糖仪（美国），日立7170型全自动生化分析仪（日本），LeicaRF2235石蜡切片机（德国）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 大鼠在实验室常规喂养1周，给药前禁食12小时，取尾血测定空腹血糖。按50mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（临用前滤菌，并用0.1mol/L、pH5.0柠檬酸缓冲液配制成2%溶液），连续监测血糖3天，血糖浓度持续大于13.8mmol/L者，确定为糖尿病动物模型（DM）。正常对照（NC）组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。DM组、NC组大鼠各30只。于成模后第1、2、4周末每组分别取10只大鼠，放入代谢笼收集24小时尿液，测定尿肌酐及24小时UAE排泄量，眶静脉取血测定血肌酐，计算内生肌酐清除率（Ccr）。分别在第1、2、4周末3个时间点处死大鼠，剖腹取双肾，称肾重后置于10%中性福尔马林溶液中固定，行光镜观察。
1.2.2 基础指标的检测 于糖尿病大鼠成模的第1、2、4周末分别检测实验组和对照组动物血糖、体重；取血样和尿样，用日立7170全自动生化分析仪检测血肌酐、尿肌酐、UAE，计算Ccr。
1.2.3 光镜观察 （1）光镜标本制作：分别于动物成模后第1、2、4周末处死实验组和对照组大鼠各10只。采用排刀法将左侧肾脏切成1.5mm厚的薄片，取双号薄片入10%多聚甲醛固定24小时，流水冲洗4小时，入梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡浸透、包埋。将各组织做5μm厚的切片，HE染色，光学显微镜下观察肾小囊及肾内血管的形态变化。（2）肾小球体积密度（VVM）测定：VVM是以肾皮质内所有肾小球的总体积占整个肾皮质体积的百分比表示，用VVM值表示肾皮质内肾小球的相对体积。每只动物随机选取3个蜡块，每个蜡块随机选取5张切片，每张切片按“S”形随机选取5个视野，在10×10倍光镜下应用方格测试系统行点计数法，根据公式VVM=∑PX/∑PC[2]（∑PX为方格测试系统落在肾皮质内肾小球的点数，∑PC为方格系统落在参照系的点数），测算出各组大鼠肾皮质内的VVM 。
1.3 数据处理 采用统计软件SPSS 12.0处理实验资料。各项指标用x±s表示，糖尿病组和正常对照组比较用t检验，糖尿病各组间比较用单因素方差分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾脏功能的变化 实验第1、2、4周末时DM组大鼠的血糖、24h尿量、肾重/体重显著升高（P＜0.01）；DM组大鼠Ccr、UAE均显著高于同期NC组大鼠（P＜0.01）；DM组大鼠VVM高于同期NC组大鼠（P＜0.01），说明DM组大鼠肾小球的体积增大；见表1。
表1 1、2、4周大鼠血糖、24h尿量、肾重/体重、Ccr、VVM、UAE变化（略）
注：*与同期NC组比较P＜0.01，△与1周DM组比较P＜0.01，#与2周DM组比较P＜0.01
2.2 肾脏形态的变化 HE染色光学显微镜下观察结果显示，1、2周时DM大鼠肾组织结构未见明显改变，4周时肾皮质内肾小球毛细血管袢减少，基质增多，肾小囊囊腔增大，见图1、图2。
图1 正常对照组大鼠肾小体石蜡切片，HE染色(×40)（略）
图2 4周糖尿病模型组大鼠肾小体石蜡切片，HE染色（×40），示肾小囊腔增大（←），毛细血管袢减少，基质增多（略）
3 讨论
据世界卫生组织最新公布的权威数据显示，全球糖尿病患者的人数已经超过1.77亿，预计到2025年将达到3.7亿。糖尿病患病率前3位的国家分别是印度、中国和美国。在美国青少年中2型糖尿病的发病率逐年上升，在体重超标和患有肥胖症的青少年中尤为突出[3]。我国糖尿病的发病率在1980年还只有0.67%，而1996年则跃升到3.2%，如今，在我国患糖尿病的人数已经超过3 000万[4]。DN是渐进性的肾脏疾病，代表了糖尿病严重的晚期并发症。DN以高血压、持续蛋白尿和进行性肾功能丧失为特征。Mogensen等[5]将DN的演进分为5个阶段：第1期以肾小球的高滤过和肥大为特征；第2期有肾小球系膜扩张和基膜增厚；第3期可检出微量白蛋白尿（20～200μg/min），伴血压从基础水平升高；第4期出现临床蛋白尿（&>200μg/min）；第5期为终末期肾病。通常情况下将前三期定为DN的早期阶段。
在本实验过程中，DM组大鼠的血糖在整个病程中均显著高于NC组大鼠。GFR、UAE是判断糖尿病肾病的重要指标。本实验在STZ诱导糖尿病大鼠成模后的第1、2、4周末分别检测DM组和NC组动物的Ccr以间接测量GFR。研究发现DM大鼠在起病的前4周内，随着病程的延长，Ccr逐渐升高，与NC组比较差异有统计学意义（P&<0.01），并且在本实验研究进程的4周内还出现UAE增多。以上的研究结果表明糖尿病大鼠的肾脏功能在病程4周时已经发生改变。
本实验通过对HE染色切片的光学显微镜观察发现在病程的第4周糖尿病大鼠肾小囊腔出现了明显增大，肾小球内血管袢减少，基质增多。我们还采用了这些切片应用体视学网格测试系统点计数法研究了VVM，研究结果显示，DM组大鼠VVM增加，这说明肾小球的体积增大。DM组大鼠肾重/体重比值从第1周开始增大，与NC组比较差异有统计学意义（P&<0.01），并且随着病程进展进行性增加。这些实验结果表明，DM组大鼠的肾脏体积增大，正常的形态结构开始发生改变。
目前，在全球范围内，糖尿病的发病呈现上升趋势。糖尿病的发病是与多种因素有关的极其复杂的过程[6]。通过对肾脏形态和功能的评价可以对早期DN作出诊断，但如何阻止或延缓糖尿病的进程仍有待于进一步的研究。
参考文献
[1] Murussi M，Murussi N，Campagnolo N，et al.Early detection of diabetic nephropathy[J].Arq Bras Endocrinol Metabol，2008，52(3):442-451.
[2] 郑富盛.细胞形态立体计量学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版，1990：6-23.
[3] Mayer-Davis EJ.Type 2 diabetes in youth:epidemiology and current research toward prevention and treatment[J].J Am Diet Assoc，2008，108(4 Suppl 1):S45-51.
[4] 李保春.2型糖尿病性肾病[M].上海：第二军医大学出版社，2003:5.
[5] Mogensen CB，Christensen CK.Predicting diabetic nephropathy in insulin–dependent patients[J].N Engl J Med，1984，311:89.
[6] Libman IM，Arslanian SA.Prevention and treatment of type 2 diabetes in youth[J].Horm Res，2007，67(1):22-34.
图2 4周糖尿病模型组大鼠肾小体石蜡切片，HE染色（×40），示肾小囊腔增大（←），毛细血管袢减少，基质增多（略）
3 讨论
据世界卫生组织最新公布的权威数据显示，全球糖尿病患者的人数已经超过1.77亿，预计到2025年将达到3.7亿。糖尿病患病率前3位的国家分别是印度、中国和美国。在美国青少年中2型糖尿病的发病率逐年上升，在体重超标和患有肥胖症的青少年中尤为突出[3]。我国糖尿病的发病率在1980年还只有0.67%，而1996年则跃升到3.2%，如今，在我国患糖尿病的人数已经超过3 000万[4]。DN是渐进性的肾脏疾病，代表了糖尿病严重的晚期并发症。DN以高血压、持续蛋白尿和进行性肾功能丧失为特征。Mogensen等[5]将DN的演进分为5个阶段：第1期以肾小球的高滤过和肥大为特征；第2期有肾小球系膜扩张和基膜增厚；第3期可检出微量白蛋白尿（20～200μg/min），伴血压从基础水平升高；第4期出现临床蛋白尿（&>200μg/min）；第5期为终末期肾病。通常情况下将前三期定为DN的早期阶段。
在本实验过程中，DM组大鼠的血糖在整个病程中均显著高于NC组大鼠。GFR、UAE是判断糖尿病肾病的重要指标。本实验在STZ诱导糖尿病大鼠成模后的第1、2、4周末分别检测DM组和NC组动物的Ccr以间接测量GFR。研究发现DM大鼠在起病的前4周内，随着病程的延长，Ccr逐渐升高，与NC组比较差异有统计学意义（P&<0.01），并且在本实验研究进程的4周内还出现UAE增多。以上的研究结果表明糖尿病大鼠的肾脏功能在病程4周时已经发生改变。
本实验通过对HE染色切片的光学显微镜观察发现在病程的第4周糖尿病大鼠肾小囊腔出现了明显增大，肾小球内血管袢减少，基质增多。我们还采用了这些切片应用体视学网格测试系统点计数法研究了VVM，研究结果显示，DM组大鼠VVM增加，这说明肾小球的体积增大。DM组大鼠肾重/体重比值从第1周开始增大，与NC组比较差异有统计学意义（P&<0.01），并且随着病程进展进行性增加。这些实验结果表明，DM组大鼠的肾脏体积增大，正常的形态结构开始发生改变。
目前，在全球范围内，糖尿病的发病呈现上升趋势。糖尿病的发病是与多种因素有关的极其复杂的过程[6]。通过对肾脏形态和功能的评价可以对早期DN作出诊断，但如何阻止或延缓糖尿病的进程仍有待于进一步的研究。
参考文献
[1] Murussi M，Murussi N，Campagnolo N，et al.Early detection of diabetic nephropathy[J].Arq Bras Endocrinol Metabol，2008，52(3):442-451.
[2] 郑富盛.细胞形态立体计量学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版，1990：6-23.
[3] Mayer-Davis EJ.Type 2 diabetes in youth:epidemiology and current research toward prevention and treatment[J].J Am Diet Assoc，2008，108(4 Suppl 1):S45-51.
[4] 李保春.2型糖尿病性肾病[M].上海：第二军医大学出版社，2003:5.
[5] Mogensen CB，Christensen CK.Predicting diabetic nephropathy in insulin–dependent patients[J].N Engl J Med，1984，311:89.
[6] Libman IM，Arslanian SA.Prevention and treatment of type 2 diabetes in youth[J].Horm Res，2007，67(1):22-34.