作者：周成江 周立社 和彦苓 杨艳芳
【摘要】 目的：观察蒙药童格勒格-1（TGLG-1）四种粗提物对大鼠正常肝细胞BRL株增殖的影响。方法：制备出蒙药童格勒格-1的乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚的提取物；体外培养大鼠正常肝细胞BRL株，通过MTT比色法观察蒙药童格勒格-1提取物对大鼠肝细胞体外毒性的量效关系。结果：蒙药童格勒格-1四种粗提物对大鼠肝细胞增殖的影响都表现为具有一个最小抑制浓度，乙醇提取物为0.3 mg/mL，正丁醇提取物为0.1 mg/mL，乙酸乙酯和石油醚提取物都为1×10-2mg/mL。在最小抑制浓度时，四种粗提物对细胞的抑制率与对照组比较差异无统计学意义（P&<0.05）。在最小用药浓度1×10-3mg/mL和每个最小抑制浓度之间，每种药都呈现出随着用药浓度增加，细胞抑制率降低的趋势。而在每个最小抑制浓度和最大用药浓度0.5 mg/mL之间，每种药都呈现出随着用药浓度增加，细胞抑制率升高的趋势。结论：蒙药童格勒格-1四种粗提物对大鼠肝细胞BRL株增殖的影响呈现出低剂量促进增殖，高剂量抑制为特征的双相剂量－效应关系。
【关键词】 蒙药童格勒格-1；大鼠肝细胞；MTT比色法
蒙药童格勒格-1是一种单味的蒙药制剂，在临床上表现出降脂、抗炎的作用。其主要成分为菊科蒿属植物的叶、茎部分，在我国分布甚广，尤其是在内蒙古地区有较丰富的资源。通过动物实验已证实童格勒格-1对高血脂模型大鼠的血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）都有显著的降低作用[1]，但其具体作用机理尚未明确，而且也未见相关文献报道。本研究希望通过MTT比色法来观察蒙药童格勒格-1四种粗提物对体外培养的大鼠正常肝细胞增殖的影响，并建立相关数据，指导蒙药童格勒格-1调脂作用机制的进一步研究。MTT比色法是一种快速测定细胞增殖的方法。噻唑蓝即3-（4，5二甲基-2-噻唑）-2，5-乙苯基四唑氮溴盐（MTT），是一种淡黄色唑氮盐，是线粒体脱氢酶的作用底物，经活细胞内线粒体脱氢酶的消化作用，被还原成不溶于水的兰紫色结晶（formazan）并沉积在细胞中，而死亡细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的兰紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在一定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。MTT法简便、快捷、经济、灵敏度高，可以用来研究药物对细胞毒性和细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株 大鼠正常肝细胞BRL株，购于中国科学院上海细胞研究所。
1.2 试剂与仪器 MTT（Amersco公司），DMEM培养基（Gbico公司），胎牛血清（杭州四季清公司），DMSO（Amersco），Forma CO2培养箱（美国），ELX-800酶标仪（美国），紫外分光光度计（日立），倒置显微镜（XDB-1B，国产）。
1.3 童格勒格－1原药 购于包头市中蒙医院药房，由包头市药品检验所中蒙药室蒋蓉主任药师鉴定。
1.4 童格勒格－1提取物制备 自然干燥童格勒格－1用95%乙醇回流3次，每次用药300g，之后用50%乙醇回流3次，每次2小时，将回流液浓缩合并后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取得到乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇的提取物。
1.5 细胞体外培养 大鼠正常肝细胞BRL株用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养。每2天换液1次。
1.6 童格勒格－1提取物对细胞增殖的影响
1.6.1 药物对细胞的干预 将大鼠肝细胞以1×104/mL的细胞密度接种到96孔培养板中培养24小时，之后将培养板中的培养液弃掉。培养板的第一行前3个孔只加培养液作为空白对照，用于比色时的调零；后6个孔只加细胞不加药，作为内对照。从第二行开始直到第八行分别加入两种药的7个浓度的药液（由细胞培养液配成）各200μL，每行的前6个孔分别为乙醇和乙酸乙酯药组，后6个孔分别为正丁醇和石油醚药组，从上到下5个药物浓度分别为0.5 mg/mL、0.4 mg/mL、0.3mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL、1×10－2mg/mL、1×10－3mg/mL，每种药的每个浓度为6个复孔，共2块96孔板。第一块96孔培养板加的药为乙醇、正丁醇提取物，第二块板为乙酸乙酯、石油醚提取物。之后将培养板置入培养箱中，在37℃和5%CO2条件下继续培养24小时。
1.6.2 MTT比色试验 24小时后取出培养板，然后弃去各孔培养液，用D-Hanks液将给药各孔洗2次，尽量去除色素影响，各孔再加完全培养液200μL和5mg/mL MTT应用液20μL，37℃培养箱继续培养4小时。4小时后弃去各孔中的液体，各孔再加150μL DMSO，室温振荡10分钟，使结晶充分溶解，用酶标仪测定各孔在495nm处的吸光度A值。此A值与活细胞数成正比。各浓度组均取测定值的平均值，通过与对照组的比较计算各实验组的细胞毒性或细胞抑制率。
1.7 统计学处理 组间比较用t检验进行统计学分析，P&<0.05提示差异有统计学意义。
2 结果
由表1和图1可见蒙药童格勒格-1四种粗提物对大鼠肝细胞的增殖都表现出一个最小抑制浓度，乙醇提取物为0.3 mg/mL，正丁醇提取物为0.1 mg/mL，乙酸乙酯和石油醚提取物都为1×10-2mg/mL。在最小用药浓度1×10-3mg/mL和每个最小抑制浓度之间，每种药都呈现出随着用药浓度增加，细胞抑制率降低的趋势。而在每个最小抑制浓度和最大用药浓度0.5 mg/mL之间，每种药都呈现出随着用药浓度增加，细胞抑制率升高的趋势。因此，蒙药童格勒格-1四种粗提物对大鼠肝细胞BRL株增殖的影响呈现出低剂量促进增殖，高剂量抑制为特征的双相剂量－效应关系。说明童格勒格-1提取物对大鼠肝细胞的抑制作用并不是随着药物浓度的增大而增加，而是在一定浓度的范围内呈现出抑制率的增加或降低。
表1 TGLG-1四种粗提取物在不同浓度时MTT检测吸光度值及细胞抑制率的变化（略）
*与对照组比较P&<0.05；细胞抑制率=（1-药物组A值/对照组A值）×100%
图1 TGLG-1四种粗提物对大鼠肝细胞毒性作用的量效关系（略）
3 讨论
近年来，采用中草药防治高脂血症已成为当今研究的重要方向，并取得了一定的成果，如黄连素、姜黄素这些从中草药中提取的药物以及一些中药制剂都已证明有降血脂的作用[2-3]。蒙药童格勒格－1是一种单味的蒙药制剂，在临床上表现出降脂、抗炎的作用，同时由于其具有不良反应少、资源丰富的特点，所以对其进行降脂作用机制的研究将对蒙药童格勒格－1以后的开发利用有重大的意义。本实验中童格勒格-1提取物对体外培养的大鼠肝细胞毒性试验结果表明，四种蒙药童格勒格-1提取物在1×10-3～0.5mg/mL浓度范围内对细胞的抑制作用并不呈直线关系，而都是以某一个浓度为最小抑制浓度为中心的“V”字形曲线，呈低剂量促进增殖，高剂量抑制为特征的双相剂量－效应关系。蒙药童格勒格－1对大鼠肝细胞的这种作用关系类似于生物界存在的“hormesis”的现象[4]。本研究所得到的实验数据对以后通过细胞培养在基因分子水平探讨蒙药童格勒格－1降脂作用机制具有十分重要的指导意义。
参考文献
[1] 吴刚，庞东卫，苗利.蒙药童格勒格-1对大鼠高脂血症的影响[J].中国现代应用药学，2006，23(4):272-274.
[2] 窦晓兵，范春雷，洪行球.姜黄素对人淋巴细胞低密度脂蛋白受体表达影响的研究[J].中国药学杂志，2005，40(13):980-983.
[3] 潘淮宁，王书奎，王自正.盐酸小檗硷对人肝Bel-7402细胞株LDLR表达的影响[J].南京医学大学学报(自然科学版)，2005，25(12):865-868.
[4] 张玉彬，金泰，金锡鹏.Hormesis简史及其中文译名[J].环境与职业医学，2005，25(6):538-539.