γδT细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用

　　　　 作者：姜晓红， 李超乾*， 何英， 邓家珍， 覃惠清， 梁国容

【摘要】 　　目的: 探讨γδT细胞在过敏性支气管哮喘发病机制中的作用。方法: 来自门诊的40例粉尘螨和屋尘螨点刺阳性、 部分控制过敏性支气管哮喘患者随机分为常规治疗组(A组)和吸入减敏组（B组）， 每组各20例。所有患者接受相同的基础治疗， 常规治疗组雾化吸入生理盐水5 mL、 吸入减敏组雾化吸入特异性变应原， 每周2次， 持续6个月。治疗前后用流式细胞术（FCM）检测外周血及诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比; IL4+、 IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比。结果: 治疗后B组外周血、 诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比低于治疗前; B组外周血和诱导痰中IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比增高。结论: 特异性变应原雾化吸入减敏疗法有效防治哮喘可能与γδT细胞有关; γδT细胞可能参与哮喘发病机制。

【关键词】 减敏 哮喘 γδT细胞 IL 4 IFN γ

　　[Abstract] AIM: To explore the role of γδT cells in the pathogenesis of allergic bronchial asthma. METHODS: Forty patients with Der.p and Der f allergy and partlycontrolled asthma were involved in a random study. Besides the fact that all patients were treated with same basic treatment. Patients in group A were nebulized with 5 mL normal saline while group B with specific allergen twice a week for six months. The percentage of γδT cells in peripheral blood and induced sputum and the percentage of IL4+ and IFNγ+ γδT cells were detected by flow cytometry(FCM) before and after treatment. RESULTS: The percentage of γδT cells in group B decreased after treatment， and the percentage of IFNγ+ γδT cells in both peripheral blood and induced sputum increased significantly in group B than that in group A. CONCLUSION: γδT cells， which may participate in the pathogenesis of bronchial asthma， may contribute to the prevention and treatment of bronchial asthma by desensitization of allergen nebulization.

　　［Keywords］hyposensitization; asthma; gamma/delta T cells; interleukin4; interferonγ

　　支气管哮喘是呼吸道常见疾病， 其病因和发病机制相当复杂， 给临床防治带来一定的困难。特异性变应原免疫疗法是惟一针对哮喘病因的治疗方法， 自20世纪80年代以来， 由于抗原进一步提纯标化， 注射方法规范化， 免疫减敏疗法进一步被肯定[1]。变应原雾化吸入减敏疗法是改变减敏途径的新的免疫疗法， 李超乾等[2]在大鼠哮喘模型中成功进行了特异性变应原雾化吸入减敏， 并发现其与皮下减敏有着相类似的细胞、 分子机制， 提示该方法应用于临床的良好基础、 前提和可行性。γδT细胞是哮喘发病机制中的重要细胞。我们主要探讨特异性变应原雾化吸入减敏疗法对过敏性支气管哮喘的防治作用及与γδT细胞的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 PEantihuman IL4、 PEantihuman IFNγ、 FITCantihuman TCR gamma delta及同型对照均购自美国Ebioscience公司。Intraprep透膜剂、 PECY5antihuman CD45购自美国Backmancoulter公司。Ionnmycin、 Monensin、 PMA、 BFA为美国Sigma公司产品。阿罗格点刺液及阿罗格变应原购自德国默克·阿罗格制药有限公司。KCW1S型超声雾化器购自南通杰西电器有限责任公司。MasterScope肺功能检测仪购自德国耶格公司。流式细胞仪为美国Backmancoulter公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组 根据GINA哮喘诊断标准， 确诊为部分控制， 皮肤过敏原测试粉尘螨、 屋尘螨阳性的门诊哮喘患者40例， 其中男23例， 女17例， 年龄16～47(33.54±8.56)岁， 无心、 肝或肾疾患， 近期无感染史， 治疗前3个月未使用过激素和免疫调节剂。随机分为A（常规治疗组）、 B（吸入减敏组） 2组， 每组各20例。

　　1.2.2 变应原的配制 在无菌条件下， 用力将浓度3级液摇匀， 吸取0.5 mL， 加入到装有4.5 mL溶媒的瓶子中， 摇匀， 稀释后立即写上“浓度2级”、 患者的姓名、 及稀释时间。以此类推， 分别配制“浓度1级”、 “浓度0级”、 “浓度1级”、 “浓度2级”、 “浓度3级”液， 于4℃保存备用。

　　1.2.3 基础治疗 评价患者临床综合指标， 填写《支气管哮喘病情调查表》及《知情同意书》。所有患者接受相同的基础治疗， 吸入替卡松/沙美特罗50/100 μg（商品名: 舒利迭， 含氟替卡松和沙美特罗2种成分， 葛兰素史克公司）， 2次/d。按需吸入短效β2受体激动剂（商品名: 喘乐宁， 每揿100 μg， 葛兰素威康公司）两喷。

　　1.2.4 分组治疗 A组雾化吸入生理盐水5 mL每周2次， 持续6个月。B组雾化吸入特异性变应原， 起始浓度以皮试强度而决定: 皮试强度+， 起始浓度1级; 皮试强度++， 起始浓度2级; 皮试强度&>+++， 起始浓度-3级。以起始浓度的第一个最小剂量0.05 mL+5 mL生理盐水雾化吸入， 雾化结束后观察30 min。剂量依次递增为0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6和0.8 mL吸入6次后再提高一个浓度级进行雾化吸入。注意事项， 常规准备肾上腺素、 地塞米松、 平衡液等急救药品和物品。嘱患者做深慢呼吸， 吸气后屏气， 以助于雾化颗粒沉积于下气道和肺泡。严格遵循雾化吸入间隔时间， 如果吸入时发生气紧、 咳嗽、 咽痒等症状， 立即停止本次治疗， 下次脱敏变应原浓度降低。患者在治疗当天要避免体力活动（避免饮酒、 热水浴等）。

　　1.2.5 诱导痰及痰标本的制作 用高渗盐水诱导痰， 其具体操作步骤采用Pin改良法[3]， 收集足量痰液于刻度离心管， 用吸管去黏液、 唾液、 分泌物后， 加入4倍体积1 g/L的DTT(二硫苏糖醇)， 用吸管轻轻吹打均匀， 37℃水浴15 min、 每隔5 min轻微搅拌1次形成细胞悬液， 用200目铜网过滤痰液以除去杂物， 以1200 r/min离心7 min， 离心弃上清后加入PBS液500 μL， 余与下同。

　　1.2.6 淋巴细胞的活化 取枸椽酸钠抗凝的外周血2 mL， 室温放置。取500 μL抗凝血（痰标本）， 加入500 μL含PMA（25μL）、 Ionomycin (20μL)、 BFA（20μL）、 Monensin(1.7μL)、 含胎牛血清的RPMI1640培养液，混匀。37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养4 h。

　　1.2.7 诱导痰及外周血中γδT细胞占淋巴细胞百分比及IL4+、 IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比测定　　将经淋巴细胞活化的外周血和诱导痰标本分A、 B、 C3管， 每管100 μL， 均加入PECY5antihuman CD4510 μL， A管加FITCIgG120 μL， B、 C管加入FITCantihumanγδTCR 20 μL、 室温暗处孵育20 min， 3管均加入Intraprep#1100 μL、 室温暗处孵育15min后， 加入PBS液4mL， 1500 r/min， 离心5min， 弃上清， 加入Intraprep#2100 μL， 室温暗处孵育5 min， A管加入PEIgG110 μL、 B、 C管分别加入PEantihumanIL4、 PEantihumanIFNγ各5 μL， 室温暗处孵育20 min， 均加入PBS液4 mL， 1500 r/min， 离心5 min， 弃上清， 溶血机溶血（痰标本中加入PBS液500 μL）。

　　1.2.8 FCM检测 打开细胞仪及氩离子激光光源（488 nm）， 预热20 min， 仪器自动初始化， 用标准荧光微球进行光路与流路校准， 所有荧光信号的变异系数（CV）均&<2%， 在侧向散射光(SS)为纵坐标， CD45PCY5为横坐标的二维散点图中设门选定CD45阳性淋巴细胞， 分别用γδT和IL4及γδT和IFNγ建立单参数直方图对CD45设门选定的淋巴细胞进行分析， 得出CD45+γδT细胞百分比， IL4+γδT细胞、 IFNγ+γδT细胞的百分比。全部数据经流式细胞仪的SYSTEMⅡ软件获取和分析。

　　1.2.9 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件包进行分析。治疗前、 后比较采用配对t检验， 两组γδT细胞优势表达比较采用χ2检验， P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 诱导痰及外周血中γδT细胞占淋巴细胞百分比测定结果 治疗后B组外周血和诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比低于治疗前（表1）。

　　表1 治疗前后两组γδT细胞占淋巴细胞百分比（略）

　　Tab 1 Percentage of γδT cells in lymphocytes after therapy and before

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs before therapy.

　　2.2 诱导痰及外周血中IL4+、 IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比测定结果 IL4+γδT细胞代表Th3优势， IFNγ+γδT细胞代表Th1优势， 治疗后B组外周血及诱导痰中γδT细胞表现为Th1优势表达， 两组比较有统计学意义（表2）。

　　表2 治疗后两组γδT细胞优势表达比较（略）

　　Tab 2 The dominance of γδT cells after therapy

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs group A.

　　3 讨论
　　
　　支气管哮喘目前尚不能根治， 但经过系统、 规范的治疗， 可达到良好的控制[4]。对于过敏性支气管哮喘而言， 最重要的一点就是尽量避免接触变应原， 实在不能避免者， 变应原特异性免疫疗法是针对病因的一种治疗方法，可减轻哮喘症状和降低气道反应性。最近的研究发现[5]经皮下注射特异性变应原1～5年后， 老年哮喘患者症状控制&>50%。Olsen等[6]对哮喘患者经特异性变应原皮下脱敏治疗1年后发现过敏性哮喘患者症状改善， 肺功能明显增加。
　　
　　一直以来大家认为支气管哮喘患者表现为Th1功能不足， Th3功能亢进， Th1/Th3比值低于正常[7]。本研究结果显示， 经特异性变应原雾化吸入减敏后外周血和诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比恢复了正常水平， 外周血和诱导痰中IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比增高。特异性变应原雾化吸入后患者哮喘症状改善， 其原因有可能是变应原长期刺激引起的免疫耐受。从实验结果看， 随着症状的改善， 外周血和诱导痰中γδT细胞数量明显减少， 且分泌较高水平的IFNγ， 抑制了IL4的产生， 进而抑制变应原特异性IgE的产生， 从而缓解哮喘症状， 提示γδT细胞可能参与了支气管哮喘的发病机制。同时， 特异性变应原反复雾化吸入长期刺激有可能从根本上治疗过敏性支气管哮喘的发生， 从理论上讲有望达到对过敏性支气管哮喘的根治。
　　
　　特异性变应原雾化吸入防治过敏性支气管哮喘的方法刚刚应用于临床， 效果明显， 未见不良反应发生， 安全可行， 但必须要在严格的医护条件下进行。目前存在的问题是规范患者雾化吸入的方法， 积累样本， 使该方法可在家中安全进行， 从而对过敏性支气管哮喘的防治起到一定的作用。

参考文献

　　[1] 钟南山. 未来十年哮喘防治展望［J］. 实用医学杂志， 2001， 17(6): 471- 472.

　　[2] 李超乾， 徐永健， 杨丹蕾， 等. 大鼠支气管哮喘模型特异性致敏原吸入减敏疗法的研究［J］. 中华内科杂志， 2003， 42(4): 284-285.

　　[3] Pin I， Gibson PG， Kolendowicz R， et al. Induced sputum cell counts: a noninvasive method to investigate airway inflammation in asthma［J］. Thorax， 1992， 47(1): 25-29.

　　[4] 孔灵菲. 最新全球哮喘防治指南解读[J]. 中国实用内科杂志， 2007， 27(4): 255-257.

　　[5] Asero R. Efficacy of injection immunotherapy with ragweed and birch pollen in elderly patients［J］. Int Arch Allergy Immunol， 2004， 135(4): 332-335.

　　[6] Olsen OT， Larsen KR， Jacobsan L， et al. A1year， placebocontrolled， doubleblind housedustmite immunotherapy study in asthmatic adults［J］. Allergy， 1997， 52(8): 853-859.

　　[7] Magnan AO， Mey LG， Caamila CA， et al. Assessment of the Th/Th3 paradigm in whole blood in atopy and asthma.Increased IFN γ producing CD8 T cells in asthma［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2000， 161(6): 1790-1796.