Fis对伤寒沙门菌基因表达的系统调节作用

　　　　作者：李安平，谢新民　茅凌翔，杜鸿，王敏，罗哲，黄新祥

【摘要】 目的： 探讨伤寒沙门菌调节因子fis对基因表达的系统调节作用。方法： 用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株，用脉冲场凝胶电泳分析fis缺陷变异株的基因组结构。利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片分析技术，比较伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株的基因表达谱差异。用重组载体pBADfis回补fis缺陷变异株，选择部分差异表达基因进行qRTPCR验证，用半固体平板培养观察野生株、fis缺陷变异株和回补株的动力。结果： fis基因缺陷变异株含有二相鞭毛素编码基因的线性质粒缺失，且动力消失;基因表达谱比较分析结果表明，伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株在对数生长期94个基因出现表达差异;qRTPCR分析所选基因表达的结果与芯片分析结果相符;fis缺陷变异株在回补fis基因后，动力及差异表达基因都获得明显恢复。结论： Fis在伤寒沙门菌中对动力、侵袭及多种代谢相关基因的表达发挥重要调节作用。

【关键词】 伤寒沙门菌; Fis; 基因芯片; 脉冲场凝胶电泳; 基因表达调节

　　[Abstract] Objective: To explore the systemic regulation of factor for inversion stimulation(fis) on gene expression in Salmonella enterica serovar Typhi.Methods： The fis deleted mutant of S.enterica serovar Typhi was prepared by homologous recombination mediated by suicide plasmid; Pulsefield gel electrophoresis was performed to investigate the genome structure of the fis mutant strain. The gene expression profiles of wildtype and fis deleted mutant of S.enterica serovar Typhi incubated at log phase were investigated by S.enterica serovar Typhi genomic DNA microarray analysis. A recombinant plasmid， pBADfis， containing the fis gene with its own promoter was constructed. qRTPCR was performed to validate the results of microarray in some selected genes. The effect of Fis on the motility phenotype was established by tests on semisolid agar plates. Results： In the fis deleted mutant， the linear plasmid containing phase 2 flagellin gene fljBA was absent and the motility was also lost; gene expression profiles analysis revealed that expression of 94 genes were induced or decreased in the fis mutant at log phase; expression of the selected genes investigated by qRTPCR was similar to the result of microarray assay; after complementing fis gene in the fis deleted mutant， the motility and expression of selected genes were obviously restored. Conclusion： Fis may play the central role in coordinating the expression of genes involved in motile， and in invasion or substance metabolism in S.enterica serovar Typhi.

　　[Key words] S.enterica serovar Typhi; factor for inversion stimulation; microarray; PFGE; gene expression regulation

　　沙门菌和大肠埃希菌含有丰富的小型结合蛋白，这些结合蛋白统称为核相关蛋白(nucleoidassociated proteins，NAPs)。核相关蛋白可与DNA结合，从而引起细菌核酸的结构变化，如DNA的位点特异性重组，也能影响复制、转录等过程[1]。Fis(factor for inversion stimulation)属小型DNA结合蛋白，最初作为一个位点特异性重组系统的辅助因子而被发现，目前已有研究表明其可作为特异性调节因子，调节某些特定操纵子基因的表达[2]。

　　一般伤寒沙门菌为一相沙门氏菌，只含有一相鞭毛素编码基因fliC，其相应的抗原为H:d抗原或H:j抗原(d抗原的缺损型，在fliC:d的可变区缺失261 bp)[3]。最近研究表明，H:z66阳性伤寒沙门菌有两相不同的鞭毛素编码基因，即一相鞭毛素编码基因fliC和二相鞭毛素编码基因fljB:z66[4，5]。2007年Baker等[6]发现fljB:z66基因存在于一特殊的约27 kb大小的线性质粒中。在鞭毛抗体存在下，鼠伤寒沙门菌等两相菌株可自行变换鞭毛素基因的表达，而H:z66阳性伤寒沙门菌经抗体诱导后只能单向变换，即只能由z66抗原转换为j/d抗原。曾有报道，Fis能够影响鼠伤寒沙门菌的鞭毛相变换[7]。最近我们利用伤寒沙门菌全基因组DNA芯片进行的相关研究表明，H:z66阳性伤寒沙门菌在鞭毛H:z66抗体诱导30 min后，基因表达有明显差异，其中fis基因表达显著上调，提示Fis可能对伤寒沙门菌鞭毛相变换及有关基因的表达有重要的影响。因此，本文拟利用伤寒沙门菌全基因组芯片进行表达谱分析，研究Fis对鞭毛及其他基因表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株和质粒 伤寒沙门菌GIFU10007、大肠埃希菌E.coli SPY372λpir、自杀质粒pGMB151;大肠埃希菌E.coli DH5α，E.coli TG1由本室保存(与本研究相关菌株与质粒详见表1)。表1 本研究所用菌株和质粒

　　1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶BamHⅠ，SalⅠ，NcoⅠ，T4 DNA连接酶、碱性磷酸酶、ExTaq，pfuTaq，RNaseFree DNaseⅠ，TA克隆试剂盒均为TaKaRa(大连)公司产品;蛋白酶K，低熔点琼脂糖，胶回收试剂盒均为Promega公司产品;荧光染料Cy3/Cy5dCTP为Amersham Pharmacia Biotech公司产品;总RNA提取试剂盒(Qiagen公司);反转录试剂盒SuperScriptⅢ(Invitrogen公司);伤寒沙门菌全基因组DNA芯片由本室研制[8]。

　　1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪2700(ABI) ;CHEF MapperTM脉冲场电泳仪;凝胶成像系统(Gene Genius Bioimaging System); 电转化仪Gene PulseroⅡ(BioRad);核酸检测仪Spectrophotometer ND1000(NanoDrop);荧光定量PCR仪(Corbett);基因芯片扫描分析系统Genepix personal 4100A(Axon Instruments)。

　　1.1.4 引物合成 本文所用引物均由上海生工生物技术公司合成，引物序列见表2。表2 引物序列

　　1.2 方 法

　　1.2.1 fis基因缺陷变异株的制备 据NCBI公布的序列信息，在fis基因上游和下游设计两对特异性PCR引物F1A/F1B和F2A/F2B，以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出499 bp和314 bp的同源性片段(分别用F1，F2表示)。用酚仿乙醇法纯化PCR产物，SalⅠ酶切F1、F2片段后，用T4 DNA连接酶进行定向连接成F1F2片段，用胶回收试剂盒回收后与pMD18T 载体连接，转化至E.coli DH5α，筛选疑似阳性克隆进行BamHⅠ酶切和PCR作进一步鉴定，用碱裂解法提取阳性克隆质粒，用BamH Ⅰ酶切阳性重组pMD18T质粒，胶回收酶切片段(F1F2)，将其克隆至pGMB151的BamHⅠ酶切位点，用热休克法转入E.coli SPY372λpir，筛选疑似阳性克隆并用BamHⅠ 酶切和PCR分析鉴定。用电击法将阳性克隆转入007野生株，按文献[9]方法筛选，将连续四次传代完全重组的菌株作为伤寒沙门菌fis基因缺陷变异株(fis-)，并经fis基因序列分析验证(由上海英骏生物技术公司完成)。

　　1.2.2 脉冲场凝胶电泳 挑取单菌落接种于4 ml LB液体培养基37℃振荡(250 r/min)过夜培养后离心(4 000 r/min， 10 min， 4℃)，收集菌体。用PIV(0.01 mol/L Tris，1 mol/L NaCl， pH 7.6)缓冲液洗涤后，取1 ml PIV缓冲液重悬细菌，与1 ml 2%的低熔点琼脂糖凝胶混匀，制作细菌凝胶模块。将模块放入新鲜溶菌液(0.006 mol/L Tris，0.1mol/L EDTA，1 mol/L NaCl，0.5%Brij58，0.2%脱氧胆酸钠，0.5%SDS， RNaseA 20 μg/ml，溶菌酶1 mg/ml)中37℃轻摇过夜，ES缓冲液(0.5 mol/L EDTA，1%SDS)洗涤模块后用ESP(含蛋白酶K 100 μg/ml 的ES)缓冲液50℃过夜消化蛋白质，最后用TE缓冲液洗涤模块后上样，电泳(电压6 V/cm，角度120°，起始转换时间1 s，最后转换时间35 s)时间18 h，电泳液缓冲液为0.5×TBE，温度保持在14℃。详细方法见文献[10]。

　　1.2.3 细菌培养及总RNA提取 挑取野生株和fis基因缺陷变异株单菌落接种于1 ml等渗LB培养液中，37℃振荡(250 r/min)培养过夜，以1∶100分别转接于20 ml等渗LB培养液中，37℃振荡(250 r/min)培养4 h至对数生长期。冰上放置15 min后离心(4 000 r/min，10 min，4℃)收集菌体。用总RNA提取试剂盒提取细菌总RNA，并用无RNA酶的DNA酶Ⅰ(37℃ 20 min，80℃ 15 min)消化残量DNA。用核酸检测仪检测RNA浓度，同时取1 μl进行琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的质量。-70℃保存RNA备用。

　　1.2.4 RNA反转录及芯片杂交 各取20 μg RNA用随机引物(N9)和基因组特异性引物(genome directed primers，GDP)[8]及反转录试剂盒进行反转录，同时掺入Cy3/Cy5dCTP进行荧光标记cDNA。为消除生物学及标记差异，对野生株和fis基因缺陷变异株的cDNA进行Cy3和Cy5配对互标，并重复两次。具体标记产物的纯化，与伤寒沙门菌基因组芯片进行杂交(42℃，15 h)参照文献[8]进行。

　　1.2.5 芯片扫描及结果分析 芯片杂交后用生物芯片扫描仪双通道扫描芯片，采用GenePix Pro6.0 软件进行图片处理和数据分析，采用荧光总值对数据进行标准化处理(global normalization)，详细操作按文献[8]进行。将四张芯片获得的各基因8个荧光信号值用Excel计算野生株和变异株各基因荧光信号比值均值R(fis-/Wt)，并进一步计算比值对数值log2 R(fis-/Wt)，以该平均值描述结果。取-1和1作为差异表达(1倍差异)的阈值。

　　1.2.6 fis缺陷变异株中回补fis基因 分别在fis基因上、下游引物Fa与Fb的5′端加上NcoⅠ， SalⅠ酶切位点，以伤寒沙门菌野生株GIFU10007基因组为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因，将纯化后的PCR产物与回补载体pBAD/gⅢ同时用NcoⅠ，SalⅠ双酶切，酶切产物以酚仿乙醇法纯化后用T4 DNA连接酶22℃过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1，筛选疑似阳性克隆并用NcoⅠ，SalⅠ双酶切和PCR分析鉴定，并经基因序列分析验证(由上海英骏生物技术公司完成)。将构建成功的阳性克隆载体转入fis缺陷变异株，将其命名为fis缺陷回补株fis-(pBADfis)，同时将空pBAD/gⅢ载体导入fis缺陷变异株作为对照。

　　1.2.7 qRTPCR 采用上述方法提取和处理细菌总RNA，取4 μg总RNA，用N8随机引物按照反转录试剂盒操作说明进行反转录。从筛选的差异表达基因中，选取3个差异基因，用特异性引物进行qRTPCR，观察基因表达。特异性引物序列见表2。

　　1.2.8 动力实验分析 挑单菌落接种于半固体培养基(10 g/L胰蛋白胨，5 g/L 酵母，10 g/L NaCl，0.3 g/L 琼脂)，37℃培养18 h，观察菌圈大小以示细菌动力。

　　2 结 果

　　2.1 脉冲场凝胶电泳结果

　　用脉冲场凝胶电泳比较野生株与fis基因缺陷变异株的全基因组结构，发现fis缺失后原本存在于野生株的线性质粒缺失(图1)，提示fis可能与该含有二相鞭毛基因的线性质粒的复制有关。

　　2.2 野生株和fis缺陷变异株等渗稳态下基因表达谱差异

　　将伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株在等渗环境下培养4 h后，提取细菌总RNA，利用基因组芯片进行基因组表达谱分析。图2为芯片杂交原始图中的1张。结果显示伤寒沙门菌fis缺陷变异株有25个基因表达上调(其中有13个功能尚不明确的基因)，69个基因表达下调(包含9个功能尚不明确的基因)，详细结果(两次实验4张芯片的重复结果)见表3。表3 Fis调节的基因

　　2.4 qRTPCR基因表达差异验证

　　选取fliA(鞭毛合成相关)，invF(侵袭相关)，dnaC(DNA复制相关)3个基因进行qRTPCR分析。3个基因在mRNA水平上与芯片的差异表达情况一致，表明芯片结果可靠。另外，回补株在mRNA水平上也都一定程度恢复到与野生株相近的水平(图3)。

　　2.5 动力实验结果

　　将伤寒沙门菌野生株，fis基因缺陷变异株，fis缺陷回补株接种于半固体培养基，37℃培养18 h后，发现fis缺陷变异株完全失去动力，而fis回补株的动力有所恢复(图4)。

　　3 讨 论

　　肠道细菌中fis基因具有高度保守性，大肠埃希菌与沙门菌的fisDNA序列有85%的同源性。Fis除了能够调节大肠埃希菌毒力基因的表达，还可以影响鼠伤寒沙门菌SPI1上的基因表达水平[11-13]。为了观察和研究H:z66阳性伤寒沙门菌中Fis对基因表达调控的影响，本次研究我们首先利用全基因组DNA芯片技术，对伤寒沙门菌野生株和fis基因缺陷变异株在一般培养条件对数生长期的基因表达谱进行对比分析，发现了94个差异表达基因，主要涉及鞭毛相关蛋白、侵袭相关蛋白、毒力相关蛋白、分泌蛋白、酶类及其他调节因子等，提示H:z66阳性伤寒沙门菌中Fis可能具有重要的调节功能。

　　采用qRTPCR对部分基因进行相对定量分析，可以对DNA芯片表达谱技术进行客观的评价。fliA，invF，dnaC位于不同的操纵子，具有不同的功能，在这些变化基因中具有一定代表性，故本研究选取fliA，invF，dnaC3个基因，进行qRTPCR分析以验证基因芯片分析结果的可靠性。图3显示qRTPCR结果与芯片结果一致，说明芯片结果可靠。

　　沙门菌的鞭毛结构很复杂，约有50种蛋白质与鞭毛的结构和功能有关。鞭毛从结构上可分为基体(basic body)、弯钩(hook)和细丝(filament)三部分。按调节层次可将与沙门菌鞭毛有关的各种基因分为3个级次[14]。二级操纵子基因主要参与鞭毛弯钩和基底部的合成组装，三级操纵子基因负责鞭毛细丝的形成，而flgK，fliD，fliC完成鞭毛的最后装配[14]。基因芯片结果显示二级操纵子基因flgB，fliA，fliF，fliL，三级操纵子基因flgK，fliD，tar表达下调，说明fis的正常表达可能有利于鞭毛的合成、装配及细菌动力的恢复。

　　沙门菌对肠黏膜黏附和侵袭的相关基因主要定位在致病岛1(SPI1)。invF基因位于SPI1三型分泌装置编码基因的上游，编码的InvF属AraC家族转录激活因子，激活侵袭相关基因的表达[15]。位于inv和spa基因下游的sip基因编码侵袭相关分泌蛋白[16]，fis缺失后侵袭相关基因(spa和sip)表达下调，同时invF的表达也显著下降，提示Fis对invF有明显的调节作用，而fis对其他侵袭相关基因的表达调节很可能是通过InvF发挥间接作用。

　　大肠埃希菌的Fis蛋白通过抑制DNA解旋酶、激活拓扑异构酶Ⅰ改变DNA的拓扑状态从而参与影响DNA复制[17，18]。脉冲场凝胶电泳结果显示，fis缺失后原本存在于野生株的线性质粒丢失，本次芯片结果中发现fis缺失后dnaC(DNA复制相关)基因表达下调，qRTPCR同时证实完整的fis基因回补缺陷变异株后，dnaC的表达恢复到与野生株相近的水平。推测Fis可能对此线性质粒的复制具有至关重要的作用。对于其中复杂的调节机制，值得深入研究。

　　另外，芯片结果显示，编码一些与新陈代谢相关酶的基因sodC(超氧化物歧化酶)， nanA(酸裂解酶)， ysgA(水解酶)， aldB(醛脱氢酶)， aceB(苹果酸合成酶)， acs(乙旋辅酶A合成酶)在fis缺失后表达明显上调，说明Fis对细菌的新陈代谢有重要的调节作用，同时证实了Fis作为转录因子对特定的启动子既可以起正调控作用，也可以起负调控作用。

　　鼠伤寒沙门菌fis缺陷变异株的动力与野生株相比明显下降[19]，并且其一相鞭毛蛋白FliC的表达依赖于Fis的调节[19] 。H:z66阳性伤寒沙门菌表达二相鞭毛抗原即z66抗原，本研究发现制备成功的fis缺陷变异株缺失了二相鞭毛抗原z66所在的线性质粒，将野生株与fis缺陷变异株进行细菌动力实验分析，发现缺陷变异株的动力几乎完全丧失，将带有自身启动子的fis基因回补至缺陷变异株后，其动力情况与野生株比较已经恢复到一定水平。因为本次实验所用的野生株一相鞭毛素编码基因为fliC:j，因此当fljB:z66随线性质粒一起丢失后，再获得的动力应当是由fliC:j(fliC:d的缺损型)的表达所致，所以其动力会略低于野生株。本次研究结果提示， 即使H:z66阳性伤寒沙门菌fljBA缺失后，fliC的表达也依赖于Fis的表达。

　　总之，本次研究结果表明，H:z66阳性伤寒沙门菌调节因子Fis对鞭毛合成、装配及细菌动力发挥着不可忽视的作用，对细菌的侵袭能力及新陈代谢有显著调节功能，对质粒DNA的复制有重要意义。

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