左旋精氨酸对糖尿病大鼠的肾脏保护作用

　　　　 作者：王丽 吴晨光 方春钱 高静 徐志刚 陈艳， 陈宇宁

【摘要】 目的： 探讨左旋精氨酸(Larginine，LArg)对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏保护作用及机制。方法： 建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型，随机分为糖尿病模型组(DM组)和DM 4周后LArg治疗组(LArg组)，并以正常组作对照。观察8周后，测定各组大鼠尿白蛋白排泄率(UAER)、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)，光镜观察肾组织形态。检测血清和肾皮质中氧化亚氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量，测定肾脏线粒体膜电位及肿胀度。结果： 与 DM组相比， LArg组大鼠UAER，SCr，BUN显著降低(P&<0.05)，肾脏病理形态得到一定改善;血清和肾皮质中NO及SOD含量显著升高(P&<0.01，P&<0.05)，MDA显著降低(P&<0.05);肾脏线粒体膜电位显著升高(P&<0.05)，肿胀度趋势增强。结论： 左旋精氨酸对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与增加NO合成，同时保护肾脏线粒体的功能有关。

【关键词】 左旋精氨酸 ; 糖尿病肾病; 氧化亚氮; 线粒体

　　[Abstract] Objective: To explore the renoprotective effect of Larginine on streptozotocininduced diabetic rats and its potential mechanism.Methods： Diabetic models were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin STZ in r+ats. Models were randomly pided into two groups:DM group(nontreated diabetic model rats)and LArg group(diabetic model rats treated with Larginine after 4 weeks ).The normal nondiabetic rats were as the control group.The excretion of urinary albumin excretion rate(UAER)， serum creatinine(SCr) and serum urea nitrogen(BUN)were detected after 8 weeks. Morphological changes of kidney were observed by optics microscope. The levels of nitric oxide(NO)，the activity of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA) in serum and renal cortex were detected;kidney mitochondrial membrane potential and mitochondrial swelling were measured in the different groups. Results： Compared with DM group，the excretion of UAER， SCr and BUN in LArg group were significantly decreased(P&<0.05)，while the abnormal pathological changes were improved; the levels of NO and the activity of SOD in LArg group were also significantly increased(P&<0.01，P&<0.05)， the levels of MDA were significantly reduced(P&<0.05); the kidney mitochondrial membrane potential was significantly elevated(P&<0.05) and mitochondrial swelling was reinforced. Conclusion： Larginine protects the kidneys during diabetic model rats possibly by increasing the levels of NO and improving the function of mitochondria.

　　[Key words] Larginine; diabetic nephropathy; nitric oxide; mitochondrial

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的慢性并发症之一，至今其发病机制尚未完全阐明。氧化应激主要由活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介导，在DN启动和发展过程中起着重要作用。在病理状态下线粒体呼吸链发生断裂，成为ROS生成的主要来源[1]。氧化亚氮(nitric oxide，NO)是新型的生物信息传递体，具有舒张血管、松弛血管平滑肌和抑制内皮细胞增殖等功能，是具有生物活性的自由基[2]。适量的NO可以清除ROS，过量的NO则抑制抗氧化系统使机体的过氧化损伤作用增加[3]。而左旋精氨酸(Larginine，LArg)作为NO的生成底物，是否对糖尿病肾病肾脏线粒体有保护作用，减少ROS的生成尚未有明确报道。本文旨在探讨LArg对糖尿病大鼠肾脏功能的保护作用及其可能的线粒体相关机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　左旋精氨酸(LArg)购自Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、氧化亚氮(NO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。生化指标检测试剂盒购自上海合富公司。SpectraMax 190 型酶标仪(Molecular Devices) ; X222R型冷冻离心机(Beckman公司);Sigma 1213 型离心机， UV2550 紫外分光光度计;RF25301PC型荧光分光光度计(岛津公司);IKAULTRATURRAXT8型匀浆机(德国IKA公司);自动生化分析仪(奥林巴斯2700);QWIN3自动图像分析系统(德国Leica公司)。

　　1.2 动物模型的建立与分组

　　清洁级雄性SD大鼠29只，体质量170～210 g，2～3月龄，由扬州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)20070001。大鼠适应性饲养1周后，按65 mg/kg一次性腹腔注射1% 链脲佐菌素诱导糖尿病模型。注射72 h后，尾静脉采血，血糖大于16.7 mmol/L入选糖尿病模型。将糖尿病大鼠随机分为2组，糖尿病组(DM组，n=10)和LArg干预组[LArg组，LArginine原粉，生理盐水配制，50 mg/(kg·d)灌胃，n=10]，并以体质量、鼠龄相匹配的正常大鼠作为正常对照组(NC组，n=9) 。NC组与DM组以等量生理盐水灌胃，共8周。实验期间，所有大鼠均采用标准饮食，可自由饮水，未使用降糖药物。

　　1.3 标本的收集

　　8周末收集各组大鼠24 h 尿，检测尿白蛋白。大鼠麻醉后，腹主动脉采血，检测生化指标。取出双肾， 分离包膜，左肾固定在4%的低聚甲醛中，用于组织形态学检测;右肾取肾皮质，制成10%的组织匀浆，检测NO含量及氧化应激指标。

　　1.4 生化指标及氧化应激指标测定

　　自动生化分析仪测定血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr);尿白蛋白测定采用免疫比浊法，并计算尿白蛋白排泄率(UAER)。NO含量采用硝酸还原酶法、SOD活性用黄嘌呤氧化酶法、MDA用硫代巴比妥酸(TBA) 法测定，均按试剂盒说明书操作。

　　1.5 肾脏形态学观察

　　肾组织经固定，常规脱水，石蜡包埋，切成4 μm厚切片，行HE染色，自动图像分析系统摄片。

　　1.6 肾脏线粒体的制备

　　根据Aprille法[4]，取各组大鼠肾脏，在预冷的分离液中剪碎，洗净，冰浴匀浆，600 g离心5 min，取上清液，8 800 g，4 ℃离心10 min，弃上清液，沉淀用4 ℃分离液洗3次，所得沉淀即为纯化的线粒体，用考马氏亮蓝法测定线粒体蛋白浓度。

　　1.7 线粒体膜电位的测定

　　根据Emaus法[5]，使用荧光染料Rh123(Rhodamine 123)作为线粒体膜电位的标记物，测定线粒体的膜电位值(Δψm)。具体测定方法如下：各组大鼠线粒体重悬于测定缓冲液中，在25 ℃条件下分别与0.3 mol/L Rh123共孵3 min后用测定液洗2次，离心后重悬于测定缓冲液，用荧光光度计测定各组线粒体悬液的荧光强度，激发波长505 nm，发射波长534 nm。荧光强度下降越多，表明线粒体膜电位越低。

　　1.8 线粒体肿胀度的测定

　　肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540 nm处的光密度值测定[6]。制备的各组肾脏线粒体重悬于线粒体缓冲液中，采用1 mmol/L Ca2+诱导线粒体肿胀实验确定结果。

　　1.9 统计分析

　　采用SPSS 11. 0 统计软件，计量数据用均数±标准差(±s) 表示，组间比较采用单因素方差分析，P&<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠的一般指标

　　DM组大鼠死亡3只，LArg组死亡2只，实验前测大鼠血糖(mmol/L)NC组5.8±1.57，DM组21.27±4.10，LArg组20.51±3.33;DM组和LArg组间血糖差异无统计学意义。

　　2.2 各组大鼠肾功能的变化

　　与 NC 组相比，DM 组和LArg组的血BUN，SCr 及 UAER 均明显升高，差异有统计学意义(P&<0.01，P&<0.05);与 DM 组相比，LArg组BUN，SCr 及 UAER 明显下降，差异有统计学意义(P&<0.05)。见表 1 。表1 各组大鼠血 BUN，SCr，UAER变化±s

　　2.3 各组大鼠肾脏病理形态的观察

　　光镜HE染色显示，与 NC组相比，DM组表现出明显的肾小球体积增大，系膜细胞显著增多，基质增生，并可见肾小管上皮细胞水肿;而LArg组与 DM组比较，肾小球体积减小及系膜细胞数减少，系膜基质轻微增生，部分小管上皮开始出现修复。见图1。

　　2.4 各组大鼠血清及肾皮质NO含量的比较

　　DM组较NC组，血清及肾皮质NO含量下降，差异有统计学意义(P&<0.01);LArg组上述指标较DM组改善，差异有统计学意义(P&<0.05) 。见表2。

　　2.5 各组大鼠血清及肾皮质SOD活性及MDA 含量比较

　　DM 组大鼠较NC组，血清及肾皮质SOD活性下降，MDA含量升高，差异有统计学意义(P&<0.01);LArg组上述指标较 DM 组改善，差异有统计学意义(P&<0.05，P&<0.01)。见表 3 。表2 各组大鼠血清及肾皮质NO含量变化表3 各组大鼠血清及肾皮质SOD活性及MDA 含量变化

　　2.6 各组大鼠肾脏线粒体功能的变化

　　2.6.1 线粒体膜电位变化 荧光染料 Rh123负载后，各组荧光强度为：NC组1 171.78±500.86，DM组466.81±141.58，LArg组943.97±176.98;与 NC组相比，DM 组线粒体膜电位显著下降，差异有统计学意义(P&<0.01)，LArg组线粒体膜电位较 DM 组显著上升，差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.6.2 线粒体肿胀度趋势 从图2可知，在540 nm处，连续检测线粒体悬液的D值，240 s，NC组，DM组及LArg组的D值的下降值(ΔD)分别为0.055，0.0135，0.0298。结果表明，与NC组比较，DM组肿胀度趋势减弱，LArg组肿胀度趋势与DM组相比增强。

　　3 讨 论

　　糖尿病慢性并发症的发生及发展有四条经典途径，即多元醇通路、己糖胺旁路、晚期糖基化终末产物、蛋白激酶C途径。Brownlee[7]提出线粒体电子传递呼吸链上的ROS产生过多可以激活四条途径，而四条途径的激活又会促进自由基的生成，彼此形成恶性循环，加速慢性并发症的进展。

　　ROS是生物体内有氧代谢产生的活性产物， MDA为ROS作用脂质的多不饱和脂肪酸形成的重要产物，MDA的量可反映机体自由基的含量和脂质过氧化程度。SOD为体内重要的抗氧化酶，其活力可反映机体抗脂质过氧化能力[8]。线粒体不仅是ROS产生的主要部位，而且是ROS攻击的首要靶点。研究报道，线粒体膜电位的变化，体外高钙诱导线粒体肿胀模型可用于线粒体功能的检测[ 9， 10 ]。

　　在本实验8周时，与正常组相比，DM组大鼠血BUN，SCr，UAER均明显升高，表明肾脏功能明显受损。DM组大鼠MDA含量升高，间接表明ROS生成增多;SOD活性显著降低，肾组织抗氧化防御能力受损;肾脏线粒体膜电位明显降低，线粒体肿胀度趋势明显减弱，表明高糖已导致线粒体发生损伤。ROS生成增多与线粒体损伤已经形成恶性循环。

　　糖尿病肾病的发生发展与NO密切相关。NO又称内皮源性舒张因子，它以LArg为底物。糖尿病肾病早期表现为肾小球内高血压、高灌注、高滤过，进而出现肾小球毛细血管襻基底膜增厚和系膜基质增多，最终导致肾小球硬化。早期NO升高参与了肾小球高灌注、高滤过的DN发病机制，早期使用LArg，NO生成增加，肾脏功能的受损加速。后期NO出现下降趋势，加速了肾小球基底膜和系膜的增生，促进了糖尿病肾小球硬化的形成。糖尿病大鼠模型建立4周时，NO则开始出现下降，此时补充LArg，对肾脏有保护作用[11]。以此为依据，本实验于糖尿病大鼠病程4周时给予LArg干预，作用4周后，与DM组相比，肾组织病理形态得到改善;生化检测BUN、SCr、UAER降低，肾脏功能出现一定程度的恢复，血清及肾皮质中NO水平有显著的升高，与先前研究结果基本一致[11]。同时实验结果显示MDA 含量显著下降，间接表明ROS生成减少;SOD活性显著升高，肾组织抗氧化防御能力得到提高;肾脏线粒体膜电位增加，线粒体肿胀度趋势增强，线粒体功能得到一定程度的恢复。

　　本实验在一定程度上证实了LArg作为NO合成的前体，小剂量NO的补充同时可以减少ROS的生成，改善糖尿病大鼠肾组织线粒体功能，延缓糖尿病肾病的进展，为LArg对糖尿病肾病肾保护机制的研究提供了新的角度，对以后的临床试验有一定的参考价值。

　　(本文图1见彩色插图)

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