远红荧光蛋白HcRed基因的原核和真核表达及鉴定

　　 作者：何志强 薛渊 石燕 杨恒 赵银霞 王楷文　周成林 王胜军 邵启祥 焦志军 许化溪

【摘要】 目的： 分别构建携带HcRed基因的PET28a(+)原核和PIRES真核载体，并分别在大肠埃希菌和鼠树突状细胞系(DC2.4)中表达、鉴定，为后续基因及蛋白的转染提供基础。方法： 参照基因库中HcRed1基因序列，设计HcRed CDS全长引物，以含有HcRed的质粒为模板，通过PCR获得目的基因，并分别连接于PET28a(+)原核载体和PIRES真核载体。经PCR、酶切鉴定后，原核载体转化大肠埃希菌，经IPTG诱导表达;真核载体用脂质体转染DC2.4，G418筛选出克隆后，应用RTPCR和流式细胞仪进行检测。结果： 扩增出687 bp的HcRed CDS区序列，构建了原核和真核表达载体PET28a(+)/HcRed和PIRES/HcRed，分别于大肠埃希菌和DC2.4细胞系中成功表达。结论： 成功构建HcRed基因的原核、真核表达载体，并分别在工程菌和细胞系中成功表达，为后续基因及融合蛋白的筛选、示踪和体内观测奠定了基础。

【关键词】 远红荧光蛋白HcRed; 树突状细胞系2.4; 原核表达

　　[Abstract] Objective: In order to use the farred fluorescent protein HcRed， we amplified HcRed gene and cloned into PET28a(+) and PIRES plasmids. Then， the HcRed was expressed and identified in E.coli and Dendritic cell line， which provided the basis for further research.Methods： The primers were designed with HcRed gene in GenBank. Using standard PCR and cloning techniques， the HcRed gene was amplified and cloned into the PET28a(+) and PIRES vectors successfully. The PET28a(+)/HcRed and PIRES/HcRed plasmids were identified by PCR amplification and restriction digestion. The PET28a(+)/HcRed plasmid was transformed into Rosetta and the red fluorescent protein HcRed was expressed in E.coli upon IPTG induction. At the same time， the PIRES/HcRed vector was transfected into Dendritic cell line by liposomes. The HcRed gene was identified by RTPCR. The expressed HcRed protein in DC2.4 was detected by FCM. Results： The 687 bp HcRed gene was amplified. PET28a(+)/HcRed and PIRES/HcRed vectors were constructed successfully and expressed in E.coli and DC2.4. Conclusion： PET28a(+)/HcRed and PIRES/HcRed plasmids were constructed successfully and expressed in E.coli and DC2.4， respectively， which brought a foundation for further research on screening，tracing and observing in vivo of the gene and protein.

　　[Key words] farred fluorescent protein HcRed; dendritic cell line 2.4; prokaryotic express

　　红荧光蛋白HcRed的前体最早是Gurskaya等[1]从紫点海葵(Heteractis Crispa)中分离的一种类似于绿色荧光蛋白(GFP)的色蛋白，通过定点突变和随机突变改造而来。改造后的HcRed最大激发和发射波长分别为592 nm和645 nm，距离其他常用荧光标记蛋白(EGFP，ECFP，EYFP等)的激发和发射波长相距甚远，因此无论单独或是联合其他荧光蛋白使用都可以方便检测。本研究旨在通过建立HcRed基因的原核和真核表达载体，并在大肠埃希菌和树突状细胞系DC2.4中成功表达，来建立应用红色荧光蛋白HcRed示踪的方法，为进一步开展融合蛋白的细胞内定位和目的基因转染示踪提供了前提，同时也为建立HcRed标记的树突状细胞系进行体内研究奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　大肠埃希菌DH5α，Rosetta，质粒PET28a(+)，PIRES，细胞系DC2.4均为本实验室保存;含有HcRed质粒模板由本校寄生虫教研室提供;试剂：LIPO2000，Trizol购自Invitrogen公司，去内毒素质粒大量制备试剂盒购自Axygen公司;rTaq酶，核酸内切酶，T4连接酶均为Fermentas产品;ReverTraAceaKit 购自ToYoBo公司;质粒小量制备试剂盒，胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自上海捷瑞公司。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物设计和PCR 根据基因库(AY952935.1)中HcRed基因CDS区序列应用Primer Primier5.0软件设计全长引物：上游序列两条分别为：5′TATGGATCCATGGTGAGCGGCCTG3′，5′ACGTCTAGAATGGTGAGCGGCCTGC3′，下划线处分别为BamHⅠ和Xba Ⅰ酶切位点;下游序列为：5′GGCGTCGACT33CAGTTGGCCTTCTC3′，下划线处为Sal Ⅰ酶切位点。预计扩增片段全长为705 bp。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。25 μl PCR反应体系：0.25 μl rTaq酶(5 U/μl )，2.5 μl 10×KCl 缓冲液，2.5 μl MgCl2(25 mmol/L)，上下游引物各0.25 μl(10 mmol/L)，1.5 μl 模板cDNA，18 μl h3O。PCR反应条件：94℃预变性5 min， 94℃变性30 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸60 s，共进行30次循环， 再72℃延伸5 min。取5 μl PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖中电泳后， EB染色， 分析鉴定。

　　1.2.2 HcRed原核和真核载体的构建 PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后分别进行BamH Ⅰ/Sal Ⅰ，Xba Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切;同时原核载体PET28a(+)和真核载体PIRES也分别进行上述酶切。胶回收后应用T4连接酶把酶切后HcRed片段分别连接于PET28a(+)(Kana+)和PIRES(Amp+)载体上。转化感受态DH5α菌株，接种已涂有硫酸卡那霉素和氨苄西林的培养皿上，37℃培养14 h。从2个培养皿上挑取单个菌落分别接种于3 ml含有100 mmol/L氨苄西林和50 mmol/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，増菌12 h后应用质粒少量制备试剂盒提取质粒。把提取的质粒分别进行BamH Ⅰ/Sal Ⅰ， Xba Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切和PCR鉴定。挑选阳性克隆増菌、冻存备用。

　　1.2.3 PET28a(+)/HcRed重组质粒诱导表达 重组质粒pet28a(+)/HcRed转化Rossta菌株经硫酸卡那霉素培养基37℃培养过夜。挑取单个菌落于液体培养基中増菌12 h，按1∶100 比例接种含有50 mmol/L硫酸卡那霉素新鲜LB 培养基中， 37℃培养至D(600 nm)处光密度为0.4～0.6时， 分别加入终浓度为0.5，1，1.5，2 mmol/L的IPTG， 然后分别在25℃，30℃和37℃继续振荡培养， 3个温度条件下分别取4，8，12，16 h收集细菌，电泳分析蛋白表达。

　　1.2.4 PIRES/HcRed重组质粒转染DC2.4细胞系 把上述携带PIRES/HcRed阳性菌在LB培养基中増菌12 h，再按1∶100 比例接种于300 ml含有100 mmol/L氨苄西林新鲜LB培养基中，37℃増菌14 h后应用去内毒素质粒大量制备试剂盒无菌提取质粒，根据脂质体LIPO2000使用说明：质粒(μg)和脂质体( μl )的比例分别按1∶1，1∶2，1∶3，1∶4加入DC2.4细胞(于24孔板中，汇合度达70%～80%)。根据转染效果选取最佳比例(1∶3)再次转染。于转染48 h后收集1孔细胞分种于5孔中过夜，按600 mg/L(由预实验选定)加入G418筛选。

　　1.2.5 HcRed在DC2.4细胞系中的表达及鉴定 G418筛选第10天见有细胞克隆，待细胞汇合度约80%时收集细胞扩种于6孔细胞培养板和75 ml培养瓶。冻存有G418抗性细胞，另取5×106个转染与未转染DC2.4细胞加入1 ml Trizol，充分混匀后室温放置5 min，提取细胞总RNA并逆转录cDNA。以获得的cDNA为模板，经PCR于转录水平检测HcRed基因。分别收集2×106个转染后和未转染DC2.4细胞，用预冷PBS 4℃ 1 000 r/min离心洗涤2次，弃去上清，重悬于1 ml预冷PBS中，流式细胞仪检测转染效率。

　　2 结 果

　　2.1 HcRed PCR扩增结果

　　应用HcRed编码区特异性引物PCR扩增获得705 bp片段，与预期结果一致(图1)。

　　2.2 PET28a(+)/HcRed，PIRES/HcRed两重组质粒单双酶切鉴定

　　PET28a(+)/HcRed重组质粒通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切，并设PET28a(+)空载和重组质粒的BamHⅠ的单酶切对照和PCR阳性对照(图2a)。PIRES/HcRed真核重组质粒应用XbaⅠ和SalⅠ双酶切，同样设置重组载体对照，空载对照和PCR阳性对照(图2b)。

　　2.3 HcRed在工程菌中的诱导表达

　　原核重组质粒PET28a(+)/HcRed转化大肠埃希菌Rosetta经条件优化后最终选取37℃ IPTG 1 mmol/L诱导12 h可获得大量HcRed蛋白(图3)。

　　2.4 RTPCR 检测HcRed基因在DC2.4细胞系中稳定转录

　　真核重组质粒 PIRES/HcRed通过脂质体转染鼠树突状细胞系DC2.4， 600 mg/L(预实验选定)G418筛选。30 d后选取G418抗性细胞提取总RNA，逆转录为cDNA作为模板，用特异性引物于转录水平检测HcRed基因，同时设定阳性和阴性对照。

　　2.5 HcRed蛋白在细胞系DC2.4中的表达

　　G418筛选30天后分别收集转染和未转染DC2.4细胞各2×106个作流式分析。结果见图5。

　　3 讨 论

　　2008年诺贝尔化学奖授给了“绿色荧光蛋白”的发现者，毋庸置疑，荧光蛋白给科学研究领域带来了巨大贡献。自1999年第一个红色荧光蛋白drFP583(DsRed)[2]发现以来，以其可与GFP 系列荧光蛋白共用，激发和发射波长更长，细胞内成像背景低等优点而受到广泛关注和应用。HcRed由最初的不发射荧光的色蛋白通过一系列定点突变和随机突变，最终改造为对温度不再敏感、且亮度提高6倍的二聚体结构[1] 。HcRed波长高达645 nm的远红荧光特性，使其在细胞定位、多色荧光分析等方面显示出更加广泛的应用前景。研究也已表明，HcRed联合GFP进行多色荧光标记，不仅扩大了视野，同时也使体内示踪、定位分析更加清晰准确[3，4]。此外，利用荧光共振能量转移技术(FRET)，可将HcRed同GFP或YFP组合应用于活体细胞内蛋白与蛋白相互作用的研究[5，6]，使活细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用可视化。

　　本实验成功获得HcRed的编码基因全长，克隆到PET28a(+)原核载体并在E.coli中表达出肉眼可见的红色蛋白，这为进一步作HcRed融合蛋白的转染等可视化蛋白作用的研究奠定了基础;构建了PIRES/HcRed真核表达载体，并在细胞系中稳定表达。基于PIRES载体双多克隆位点的特性，而HcRed基因位于MCS B留出MCS A可以插入目的基因，这样既起到目的蛋白筛选指示作用，又可以避免表达为融合蛋白而影响目的蛋白功能，同时结合实验室的绿色荧光蛋白为多基因的转染示踪、蛋白定位以及蛋白质间相互作用的功能分析提供了条件。

　　众所周知，免疫应答总是同时产生对机体的免疫保护和免疫损伤两种结果，如何调节机体在最大限度地排除异物而发挥免疫保护作用的同时，又尽可能少地引起机体的炎症损伤，是免疫学研究的中心问题。树突状细胞是重要的抗原提呈细胞，在一定程度上决定着免疫应答的方向，既参与免疫保护作用的调节，也与免疫损伤所导致的免疫相关性疾病的发生发展密切相关。将HcRed基因转染树突状细胞DC2.4，制备稳定的HcRed修饰树突状细胞系，无疑将有助于深入开展体内可视化树突状细胞功能的研究，也为目的蛋白和基因的转染研究提供了探索的空间。

参考文献

　[1] Gurskaya NG， Fradkov AF， Terskikh A， et al. GFPlike chromoproteins as a source of farred fluorescent proteins[J]. FEBS Lett， 2001， 507(1): 16-20.

　　[2] MatzMV， Fradkov AF， Labas YA， et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species[J]. Nat Biotechnol， 1999， 17(10): 969-973.

　　[3] RafalskaMetcalf IU， Janicki SM. Show and tell: visualizing gene expression in living cells[J]. J Cell Sci， 2007， 120(14): 2301-2307.

　　[4] Fradkov AF， Verkhusha VV， Staroverov DB， et al. Farred fluorescent tag for protein labeling[J]. Biochem J， 2002， 368(1):17-21.

　　[5] Goedhart J， Vermeer JE， AdjoboHermans MJ， et al. Sensitive detection of p65 homodimers using redshifted and fluorescent proteinbased FRET couples[J]. PLoS ONE， 2007， 2(10): e1011.

　　[6] van der Krogt GN， Ogink J， Ponsioen B， et al. A comparison of donoracceptor pairs for genetically encoded FRET sensors: application to the Epac cAMP sensor as an example[J]. PLoS ONE，2008， 3(4):e1916.