缺氧诱导因子1α在实验性大鼠肾间质纤维化过程中的作用

　　　　作者：罗燕萍， 李晶， 芮金兵， 何建强， 王晓明

【摘要】 目的： 观察单侧输尿管梗阻(ulilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型肾组织中缺氧诱导因子1α(HIF1α)的表达，探讨HIF1α表达水平与肾小管间质纤维化的关系。方法： 40只雌性SD大鼠随机分为2组，假手术组，UUO组(每组20只)。制备UUO大鼠模型，术后第7天 、第14天处死大鼠，肾组织行HE和Masson染色，免疫组织化学和实时荧光定量PCR(RTPCR)检测HIF1α，Ⅰ型胶原(collagenⅠ，ColⅠ)及α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin， αSMA)在肾组织中的表达。 结果： 假手术组与UUO组各时间点肾小管间质纤维化评分比较，差异有统计学意义(P&<0.01)。术后HIF1α mRNA水平随梗阻时间延长而递增。UUO组HIF1α蛋白表达量随着肾间质损害加重而增加，HIF1α蛋白主要分布在肾小管，其中以近曲小管表达最明显。HIF1α表达水平与肾小管间质纤维化评分，αSMA和ColⅠ的表达水平均存在正相关(R值分别为0.71，0.68，0.82，P均&<0.05)。结论： HIF1α在肾小管上皮细胞内高表达可能参与了肾间质纤维化发生和发展的过程。

【关键词】 缺氧诱导因子1α;肾间质纤维化;单侧输尿管梗阻

　　[Abstract] Objective: To investigate the role of hypoxia inducible factor 1alpha(HIF1α)in renal tubulointerstitial lesions induced by unilateral ureteral obstruction(UUO).Methods： Randomly， 40 female SD rats were pided into sham operation group and UUO group， with 20 in each. The left ureters were exposed， and in the UUO group they were also ligated. On day 7 and 14， some of the kidneys were harvested to study in them the expressions of renal tubular interstitial fibrosis， the expressions of mRNAs of HIF1α， αsmooth muscle actin(αSMA) and collagenⅠ(ColⅠ) with RTPCR and the expressions of these proteins immunohistochemically. Results： Compared with sham group，the scores of renal interstitial fibrosis in UUO rats were higher significantly. HIF1α mRNAs increased with time after operation in the kidneys in the UUO rats. And the protein expression of HIF1α increased in the kidneys obtained on the 14th day after operation. Immunohistochemically HIF1α mainly expressed in renal tubular epithelial cells，especially in proximal tubular cells. The renal tubulointerstitial expression of HIF1α was positively associated with the scores of renal interstitial fibrosis and the expression of αSMA and ColⅠ. Conclusion： HIF1α may play an important role in mediating the renal tubulointerstitial fibrosis.

　　[Key words] hypoxia inducible factor 1alpha; renal interstitial fibrosis; unilateral ureteral obstruction

　　肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis， RIF)是慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰的共同途径。肾小管上皮细胞转分化(epithelialtomyofibroblast transition， EMT)在RIF的发生、发展中起着重要作用[1]。慢性缺氧是导致RIF主要因素之一，而缺氧对肾脏损害的作用主要是通过缺氧诱导因子1α(HIF1α)介导的[2]。HIF1α能够调节多种与RIF有关的细胞因子的表达，增加EMT。所以，HIF1α可能是促进RIF的关键因子[3，4]。

　　已知HIF1α在IgA肾病、大部肾切除、慢性马兜铃酸肾病动物模型肾组织中异常表达，但在肾间质纤维化模型单侧输尿管梗阻(ulilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型肾组织中的表达尚未见报道。本研究通过建立大鼠UUO模型，观察HIF1α在肾组织中的表达，探讨HIF1α与肾小管间质纤维化的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　小鼠抗大鼠HIF1α单克隆抗体，购自Novus公司(美国)，山羊抗大鼠Ⅰ型胶原(ColⅠ)多克隆抗体及小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，αSMA)单克隆抗体购自Santa Cruz公司(美国)，大鼠HIF1α，αSMA，ColⅠ，GAPDH引物由上海生工合成。

　　1.2 动物分组

　　选择清洁级SD雌性大鼠40只，8周龄，体质量190～210 g(江苏大学实验动物中心提供)，按随机数字法分为2组，假手术组， UUO组，每组20只。①UUO组：制作大鼠UUO 模型， 大鼠予氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，剪毛后常规消毒，行左侧腹切口，分离左侧输尿管，丝线结扎2道，上一道结扎点位于左肾下极水平，然后结扎点间剪断输尿管，逐层缝合肌肉、皮肤层。②假手术组:假手术组开腹后不结扎输尿管，关闭腹腔，作为对照组。

　　1.3 标本采集

　　各组大鼠分别于术后7 d，14 d处死(n=10)，取左侧肾组织，一半常规石蜡包埋切片，一半立即存放于80℃冰箱。

　　1.4 检测方法

　　1.4.1 肾脏常规病理检查 大鼠肾组织经4%低聚甲醛固定过夜，浸蜡，石蜡包埋，制成厚度3 μm切片，经HE和Masson染色，光镜下观察肾小管间质病变。

　　1.4.2 肾脏免疫组织化学检查 使用二步法(Envision显色系统)。脱蜡和水化组织切片。抗原热修复，蒸馏水漂洗，置于三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS)中。3% h3O2阻断内源性过氧化物酶，孵育10 min。蒸馏水漂洗，置于TBS中10 min。加入第一抗体(稀释度HIF1α 1∶500， αSMA 1∶500，ColⅠ1∶500)4℃孵育过夜。TBS漂洗10 min。色源底物溶液DAB孵育，光镜控制显色。蒸馏水漂洗，复染及封固。PBS代替一抗为阴性对照，已知阳性片为阳性对照。

　　1.4.3 实时荧光定量PCR(RTPCR)检查 利用TRIzol一步法提取肾组织总RNA，取2 μg RNA进行逆转录合成cDNA。取2 μl cDNA作模板用HIF1α，αSMA，ColⅠ和GAPDH引物行PCR扩增(终体积20 μl)。在德国Roche Lightcycler PCR仪上进行扩增。反应条件：预变性：95℃ 10 s，20℃ 1s 1个循环，PCR反应: 95℃ 10 s，20℃ 1s，60℃ 20 s，20℃ 1s，40个循环，溶解曲线分析：95℃ 10 s，20℃ 1s，65℃ 15 s，20℃ 1 s，95℃ 10 s，0.1 ℃ 1 s。引物序列和扩增片段长度见表1。数据是通过参照基因GAPDH作标准化处理得到的ΔCT值(ΔCT=各组基因CT-各组参照基因GAPDH CT)，然后再选取代表1倍目的基因表达量的样本为对照因子，处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式2-(ΔΔCT)计算得到。ΔΔCT=(实验组ΔCT-对照组ΔCT)。表1 PCR引物序列

　　1.5 图像分析

　　1.5.1 Masson染色肾间质纤维化的半定量分析 200倍光镜下，随机选取20个连续不重复的视野，根据蓝色着色的肾间质纤维化区域面积占同视野小管间质总面积的百分比，取各组平均值，积分定义如下：0分(无病变);1分(&<10%);2分(～25%);3分(～50%);4分(～75%);5分(&>75%)。

　　1.5.2 免疫组织化学染色评分 肾间质HIF1α，αSMA表达按以下方法评估：0分(肾间质无表达);1分(轻度表达，即表达不超过视野30%);2分(中度表达，即上述面积为31%～60%);3分(重度表达，上述面积超过61%);4分(极重度表达，大面积肾小管萎缩，被大面积表达HIF1α，αSMA组织代替)，计算20个肾皮质高倍视野(×400)分值，取其均值。ColⅠ表达的半定量法：根据光镜下染色在肾间质的分布：0分(无染色);1分(局部染色);2分(轻至中度弥漫染色);3分(重度弥漫染色)，计算20个肾皮质高倍视野(×400)分值，取其均值。以上评分均由3人盲法同时进行，取平均值。

　　1.6 统计学方法

　　所有计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，各项指标间相关关系采用Spearman等级相关系数表示，P&<0.05为差异有统计学意义。数据计算以SPSS13.0统计软件完成。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠肾脏病理变化

　　Masson染色结果显示，假手术组各时间点肾脏病理未见明显异常。UUO组各时间点肾小球结构均无明显病理改变，UUO术后7 d组肾小管明显扩张，并见萎缩肾小管，间质宽度明显增加。UUO术后14 d组萎缩肾小管数量明显增加，间质纤维化更 加明显(见图1，2)。

　　2.2 肾组织HIF1α，αSMA，ColⅠ蛋白的表达

　　免疫组织化学结果显示，假手术组各时间点肾小管上皮细胞仅有少量HIF1α表达。与假手术组同时间点比较，UUO组术后7 d肾小管上皮细胞胞质HIF1α表达显著增加，术后14 d肾小管上皮细胞胞质HIF1α表达进一步增强，与UUO术后7 d组相比差异有统计学意义(P&<0.01)，HIF1α蛋白表达以近曲小管上皮细胞最为明显。

　　假手术组各时间点均无αSMA表达，UUO组术后7 d部分肾小管上皮细胞胞质及肾间质区域少许细胞胞质表达αSMA，与假手术组同时间点比较，αSMA表达量显著增加;UUO组术后14 d肾小管上皮细胞胞质及肾间质细胞胞质αSMA表达进一步增强，与UUO术后7 d组相比差异有统计学意义(P&<0.01)。假手术组各时间点肾间质区域仅有少量ColⅠ表达，与假手术组同时间点比较，UUO组术后7 d肾间质表达ColⅠ显著增加，UUO组术后14 d肾间质表达ColⅠ进一步增强，与UUO术后7 d组相比差异有统计学意义(P&<0.01)，见表2，图3。表2 大鼠肾组织HIF1α，αSMA，ColⅠ蛋白表达评分

　　2.3 肾组织HIF1α，αSMA，ColⅠmRNA的表达

　　RTPCR结果显示，假手术组HIF1α，αSMA，ColⅠ基因均有少量表达，UUO组HIF1α，αSMA，ColⅠ基因表达较假手术组增多，差异有统计学意义(P&<0.01)，且UUO 14 d组表达更为明显(P&<0.01)，见表3。表3 大鼠肾组织HIF1α，αSMA，ColⅠ基因相对表达量

　　假手术7 d组假手术14 d组UUO 7 d组UUO 14 d组HIF1α基因0.99±0.0761.01±0.083.64±0.42a5.03±0.03b，cαSMA基因0.98±0.0401.17±0.414.84±0.40a7.64±0.52b，cColⅠ基因0.98±0.0421.04±0.062.71±0.19a4.32±0.37b，c a：P&<0.01，与假手术7 d组比较; b:P&<0.01，与假手术14 d组比较;c：P&<0.01，与UUO 7 d组比较

　　2.4 相关性分析

　　将两组大鼠肾组织HIF1α表达水平与相应的纤维化指标进行相关性分析，结果显示，UUO术后14 d，HIF1α表达水平与肾小管间质纤维化评分，αSMA，ColⅠ的表达水平均存在正相关，相关系数分别为0.71，0.68，0.82，P均&<0.05。

　　 3 讨 论

　　HIF1是异源二聚体转录因子，包含一个结构性表达的β亚单位和一个氧调节的α亚单位[5]。常氧状态下，脯氨酰羟化酶羟化HIF1α，使之与肿瘤抑制蛋白结合，进而使HIF1α分子泛素化并经泛素2蛋白酶小体途径被降解。细胞缺氧时，HIF1α不能被羟化，致使其表达量在细胞内呈指数式上升，并转位至细胞核与HIF1β形成二聚体，进而形成活化的HIF1转录因子。HIF1可与含有缺氧反应元件的靶基因结合并激活其转录。近年的研究表明HIF1α与RIF有关。Kimura等[6]制作pVHL/基因敲除小鼠，发现60周龄的pVHL/小鼠肾间质纤维化面积明显增加，注射HIF1α拮抗剂YC1后可抑制pVHL/小鼠肾纤维化的进展。Debra等[7]研究发现有小管间质损伤的慢性肾病患者肾组织HIF1α表达增加。本研究发现UUO大鼠肾组织HIF1α表达增加，HIF1α表达水平与肾间质纤维化评分及ColⅠ表达水平呈正相关，提示HIF1α参与了肾组织的RIF过程。

　　本研究还发现，在假手术组正常肾脏近曲肾小管上皮细胞仅有少量HIF1α表达，部位主要位于皮髓交界处的近曲肾小管上皮细胞。有学者应用低氧探针证实正常大鼠肾脏外髓质区的小管就处于轻度缺氧状态[8]，由此可以解释该区HIF1α表达的原因。已知UUO大鼠模型缺氧范围和程度明显增加，低氧主要集中在近端肾小管上皮细胞，最先受累且程度最重的是生理条件下就处于低氧边缘的外髓部位的肾小管[9]，这也可解释UUO大鼠皮髓交界处近曲肾小管上皮细胞HIF1α高表达的特点。

　　肾小管上皮细胞转分化已被广泛认为是RIF发生的重要机制。缺氧可以依赖HIF1α的方式诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，而后者可产生大量细胞外基质，加速肾间质纤维化的发展[6]。αSMA为肌成纤维细胞标志性抗原，小管间质区域αSMA的表达量与间质纤维化直接相关[10]。本研究结果显示，UUO大鼠肾间质区域αSMA表达上调，且 HIF1α表达与αSMA表达呈显著正相关，提示在UUO大鼠模型，肾间质区域出现了大量转分化而来的肌成纤维细胞，且高表达的HIF1α能促进肾小管上皮细胞转分化，所以我们认为HIF1α可能是促肾间质纤维化的重要因子。

　　本研究结果显示，HIF1α表达与ColⅠ表达呈显著正相关，这进一步提示HIF1α与肾间质纤维化密切关联。HIF1α可通过HRE促进多种与肾间质纤维化有关的下游靶基因的转录与激活，如转化生长因子β1、结缔组织生长因子、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂等，结果可造成包括ColⅠ在内的细胞外基质合成增多、降解减少，导致ECM在肾间质过度沉积，从而加重肾间质纤维化病变。

　　总之，HIF1α的高表达可能参与了肾小管间质纤维化的发生与发展过程，但其确切机制尚不清楚，有待于进一步研究。

　　(本文图1，图3见彩色插图)

参考文献

　[1] 刘 娜，严海东.肾小管上皮细胞转分化在肾间质纤维化中的研究进展[J].国际泌尿系统杂志，2006，26(6)：854-858.

　　[2] Masaomi N，Reiko I，Toshio M，et al.Hypoxia and hypoxiainducible factor in renal disease[J].Nephron Exp Nephrol，2008，110(1):e1-e7.

　　[3] Eckardt KU，Bernhardt WM，Weidemann A，et al.Role of hypoxia in the pathogenesis of renal disease[J].Kidney Int Suppl，2005，99:S46-51.

　　[4] Higgins DF，Kimura K，Iwano M，et al.Hypoxiainducible factor in the development of tissue fibrosis[J].Cell Cycle，2008，7(9):1128-1132.

　　[5] 张崇高，曹茄柽. 细胞对缺氧的感知及其生物学意义[J]. 江苏大学学报：医学版，2006，16(1):82-86.

　　[6] Kimura K，Iwano M，Higgins DF，et al.Stable expression of HIF1alpha in tubular epithelial cells promotes interstitial fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2008，295(4):1023-1029.

　　[7] Debra F，Higgins DF，Kuniko K， et al. Hypoxia promotes fibogenesis in vivo via HIF1α simulating of epithelialtomesenchymal transition[J].J Clin Invest，2007，117(12):3810-3820.

　　[8] 刘春凤，丁小强，朱加明，等.低氧在单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化中的作用初探[J].复旦学报：医学版，2007，34(5):732-736.

　　[9] Rosenberger C， Mandriota S， Wiesener MS，et al. Expression of hypoxiainducible factor1α and2α in hypoxic and ischemic rat kidneys[J].J Am Soc Nephrol，2002，13(7):1974-1976.

　　[10] 黄凌红，张国强，叶任高，等，细胞增殖与凋亡在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化发病中的意义[J].中华肾脏病杂志，2000，16(1)：24-27.